角膜再生のためのニッチを装備膜を製造するためのマイクロ光とエレクトロスピニングの組み合わせ

倫理に関する声明：本研究​​で用いた目が動物研究上の開放性に関する宣言に従って使用した。 Micropockets装備PLGA生分解性膜の作製1。 リング足場はマイクロ光とエレクトロスピニング技術31の組み合わせによって作成された。本質的には、プロセスは、マイクロ光と、（ii）基礎となるPEGDA構造の再生のためのテンプレートの上に電界紡糸（この場合、微細加工されたリング）によってPEGDAテンプレート2部（i）の作成に要約することができる。これらの2つのステップは（ 図1および2）以下に詳細に説明する。 マイクロ光によるPEGDAテンプレートの作製（microSL） 第一の層（L1）構造のベースと馬蹄Morphologiの6 micropocketsを提示する第二の層（L2）であると、2層モデルを用いて環を作製300-500ミクロンのサイズの範囲におけるES。 PEGDAリングの製造は、最近、このグループ22で説明した。 任意の適切な描画プログラムを使用して1.2センチメートル黒い丸を描くことによってL1を作成する。 同じように、L2を作成したが8白0.5×0.35ミリメートル馬蹄形の構造が挙げ​​られる。黒丸構造内の小さな白い馬蹄形状を配布します。 JPEG形式でL1とL2を保存します。 暗色ガラスバイアル中で、20分間マグネチックスターラー上、カンファーキノン、光開始剤w / wの1％ポリエチレングリコールジアクリレート（PEGDAはMn = 250グラム/モル）を混合する。 セットアップ望遠レンズ構成を使用してマイクロ光のレーザ光を展開してから、コンピュータプログラム可能なデジタルマルチミラーデバイス（UV対応のDMDスターターキット）の上に投影する。注：DMDを10cm、焦点距離チューブレンズを介してミラーの上に（この場合はリング）のイメージを反映している。画像は、銀COAによって指示されるテッドは、光硬化性ポリマー（PEGDA）を含むバイアルに反映しています。 調整し、慎重に設定するマイクロ光の光学部品をクリーニングします。 12ウェル組織培養プレートのウェルにPEGDA液を300μlを入れてください。ウェルは、硬化後の構造を容易に除去するためのテフロンまたは他の非粘着性材料でプレコーティングされていることを確認してください。 青色レーザー（MBL-III 473nmで、150 MW）に切り替えて、以前にPCにインストールされALP3-基本ソフトウェアにL1をアップロードします。 60秒間の第一層を照射する。注：ALP3-基本は、PCやデジタルマイクロミラーデバイス間のリンクを提供し、USBインターフェースです。 、ウェルにPEGDAのより250μlを加え、上記のようL2をアップロードして、60秒間、L2を照射。 未硬化ポリマーを取り出し、イソプロパノール、O / Nと共に環を洗う。 エレクトロスピニングを使用して、生分解性PLGA膜の作製 NOTE：PEGDAリングがテンプレートとして使用したsがその上PLGAはそれは、これらのテンプレートの上にスピンさとしてPLGAは、基礎となる地形を再現して電界紡糸した。紡糸した後、PLGAポリマーのシートは、集電体から剥離した。最後のPLGA膜は、金属製の集電体に付着したままにしたPEGDAリングが含まれていませんでした。 静的なエレクトロスピニングコレクタを作成するための電気めっきアルミニウムシート上のPEGDAリング（12センチ×20センチメートル）を配布します。 導電性カーボンテープを用いてリングを取り付けます。注：一旦形成これらの環は、エレクトロスピニングのための鋳型として再使用することができる。 紡糸用ポリマー溶液を調製します。濃度はw / wの20％のジクロロメタン（DCM）：PLGA（グリコリド（48モル％）44 /モル50:50 DL-ラクチド（52モル％））を溶解する。 O / N使用前にかき混ぜる。 シリンジポンプに（エンド、0.8センチメートル内径の針を平滑）4インスリン注射器を置きます。注：四注射器は、単一の注射器での作業よりも迅速エレクトロスピニングを確実にした。 各シリンジにPLGA溶液2.5mlのをロードします。 12〜15 kVの範囲を30μl/分の流量と電圧を使用して、エレクトロスピニング。針さ15cmのコレクタとの間の距離のままにしておきます。 エレクトロスピニング1時間30分間、最後に慎重にPEGDAリングをサポートするコレクタからのPLGA電界紡糸シートをはがします。 円形の穴パンチを使用し、中央に位置する環構造を残して直径22mmの円形にエレクトロ足場をカット。 PLGA微細加工膜の2。長期保管注：PLGAリングを作製し、認定外部企業によって滅菌した。サンプルは25〜40 kGyでの外部用量範囲で照射した。 小さな容器（プラスチックシャーレ）中で膜をマウントし、医療グレードの袋の中に入れてください。 乾燥剤のための小さなフィルターバッグを作成するためにろ紙を使用してください。 TO、バッグを作成し、ろ紙（125ミリメートル径）倍と半分になり、半円をカット。その後、テープを使用して一緒に端をシールする。 それぞれ、シリカオレンジ、コバルト（II）、塩化銅（II）硫酸塩1gを3つのフィルタ紙袋を埋める。 エレクトロ膜と一緒に医療グレードの袋の中に乾燥剤の3つの袋を置く。 貯蔵期間中の任意の水分の蓄積を検出するためにバッグに市販の6点の湿度インジケータカードを追加する。 真空袋を密封する真空ヒートシール機を使用してください。 γ線照射のために外部の会社にリング膜を送信します。 店舗5％CO 2を含むインキュベーター内に湿潤環境で37℃まで-20℃から広範囲の温度でPLGA膜をγは、照射した。 ポストストレージは、湿度レベルは30％の下にあることを確認するために湿度インジケータを調べます。 Uそれ走査型電子顕微鏡（SEM）繊維の完全性を評価した。 縁外植片の3分離ウサギ縁外植片を（ウサギの消費のために飼育されている農場から得た）ウサギの眼から単離した。 消毒液（10％）を使用して、ウサギの眼を消毒。 角膜の周囲の余分な組織を除去することで、目をきれいにします。 解剖顕微鏡を使用して角膜の残りから（角膜（透明）と強膜（白）の間の薄い円形の領域として識別される）角膜縁領域に分離します。 解剖顕微鏡下でセグメント（長い約1.5センチ）にカット。 1分間、1.5％の消毒液での輪部のセグメントを駆除。 外科用メスの刃で小片（100〜500ミクロン）に輪部のセグメントをカットします。 Ham's F12（1：1）、10％ウシ胎児血清、1 U / mlのペン培養培地中の組織の小片（DMEM +グルタマックスを格納するicillin、100 mg / mlのストレプトマイシン、2.5 / mlのアンホテリシン、EGF、10 ng / mlで、37℃でのインスリンで5μg/ ml）および5％CO 2を使用するまで（せいぜい60分）。 輪部外植片からの細胞の伸長4。 ウサギ角膜縁の外植片を真空パックし、-20℃で6ヶ月間保存した両方たてスピンし、微細加工された膜や、膜上に置いた。 コー​​トフィブリン糊15μlのと環足場：フィブリンを分配するための、細胞スクレーパーを用いて（1〜2.5 U / mlの濃度でヒト血漿から18.75 mg / mlのトロンビンの濃度でヒト血漿からフィブリノーゲン1混合物）均等に。 25 G針と解剖顕微鏡を使用したPLGA micropocketsに直接組織外植片を置きます。 外植片を切り離す避けるために、非常に静かに細胞培養培地を追加します。 3日おきに（メディアレシピは3.7節で説明）とkメディアを変更加湿した37℃のインキュベーター中、5％CO 2中で2週間培養物中のチュー。 PBSで3回洗浄し、10分間、3.7％緩衝ホルムアルデヒドを有するサンプルを修正しました。 RTで10分間、4 '、6 – ジアミジノ-2 – フェニルインドール（DAPI）またはヨウ化プロピジウム（PI）を1μg/ mlの中でのインキュベーションによって対比染色。 PBS中で3回洗浄し、ホイルで覆われたサンプルを格納。 画像543および800nm​​（二光子）の波長で蛍光顕微鏡を用いた試料。 5。設定アップウサギ傷ついた角膜の3Dモデルクリーンし、上記のようにウサギの眼を消毒。 5分間、0.14％水酸化アンモニウムでそれらを浸漬することにより、ウサギの眼に巻か。 PBS中で目をすすぎ、硬節ナイフで上皮を削り取る。 切り取り、残りの組織を除去する角膜 – 強膜ボタンを隔離。 角膜の上皮側を置きダウンへ無菌カップとDMEM中で行われた0.5％の寒天を埋める。 一度設定して、小さなペトリ皿に、角膜の上皮側を上に入れて、輪部エリアまで培養培地（上記のレシピ）を追加します。注：角膜全体をカバーしないでください。気液界面での器官培養を続ける。 角膜縁の外植片とウサギ角膜の3次元モデルにおけるリング足場を含める6。離コー​​トはフィブリン糊15μlのと環膜：上記細胞スクレーパー.USE（1〜2.5 U / mlの濃度で18.75 mg / mlのトロンビンの濃度でフィブリノゲンの1の混合物）に記載されているよう。 25 G針と解剖顕微鏡を使用したPLGA micropocketsに直接組織外植片を置きます。 上に向け外植片とし、気液界面の状態で裸に角膜上の組織外植片とリングを置きます。 （これらの条件は、先22に記載されている）。 のための器官培養モデルを維持37℃の加湿インキュベーター中で4週間、5％CO 2、2日毎に培地を交換。 角膜再生の7評価と細胞の維持幹 4週間後、3.7％ホルムアルデヒドを使用して角膜を修正。 6μmのパラフィン切片を作製するために、従来の組織学のために角膜を処理します。 ヘマトキシリン​​およびエオシン（H＆E）で染色する。 免疫細胞化学のために、キシレン（3分）で切片を脱蝋し、100％エタノール（1分）、70％エタノール（1分）、蒸留水（2分間）中で再水和する。 小さな領域を区切ると抗体の過度の使用を避けるために、ダコペンを使用してセクションを描く。 20分（37℃）0.05％トリプシン（100μL）で描かれた領域を扱います。 PBSで徹底的に洗浄し、1時間、10％ヤギの血清（ブロッキング）を100μlを追加。 マウスモノクローナル抗体cytokera100μlのサンプルをインキュベートスズ3（CK3）と4℃で1％のヤギの血清でO / NでのP63を100μl。 PBSで洗浄し、ビオチン化二次抗マウス抗体（1：1％ヤギ血清1000）100μlで扱うRTで1時間。 RTで30分間：FITC-ストレプトアビジンを100μl（1％ヤギ血清中の100 1）を追加します。 上記のようにDAPIでサンプルを扱う。 画像は800nm​​（二光子）および488nmの波長で蛍光顕微鏡を用いた試料。