En los miocitos cardíacos, estructuras tubulares de membrana forman redes intracelulares. Se describen protocolos para i) el aislamiento de los miocitos de corazón de ratón, incluyendo el control de calidad, ii) la tinción de células vivas para la microscopía de fluorescencia estado-of-the-art optimizado, y iii) el análisis de imagen directa para cuantificar la complejidad de los componentes y la plasticidad de la membrana intracelular redes.
In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules – the transverse-axial tubule system (TATS) – controls deep intracellular signaling functions. While the outer surface membrane and associated TATS membrane components appear to be continuous, there are substantial differences in lipid and protein content. In ventricular myocytes (VMs), certain TATS components are highly abundant contributing to rectilinear tubule networks and regular branching 3D architectures. It is thought that peripheral TATS components propagate action potentials from the cell surface to thousands of remote intracellular sarcoendoplasmic reticulum (SER) membrane contact domains, thereby activating intracellular Ca2+ release units (CRUs). In contrast to VMs, the organization and functional role of TATS membranes in atrial myocytes (AMs) is significantly different and much less understood. Taken together, quantitative structural characterization of TATS membrane networks in healthy and diseased myocytes is an essential prerequisite towards better understanding of functional plasticity and pathophysiological reorganization. Here, we present a strategic combination of protocols for direct quantitative analysis of TATS membrane networks in living VMs and AMs. For this, we accompany primary cell isolations of mouse VMs and/or AMs with critical quality control steps and direct membrane staining protocols for fluorescence imaging of TATS membranes. Using an optimized workflow for confocal or superresolution TATS image processing, binarized and skeletonized data are generated for quantitative analysis of the TATS network and its components. Unlike previously published indirect regional aggregate image analysis strategies, our protocols enable direct characterization of specific components and derive complex physiological properties of TATS membrane networks in living myocytes with high throughput and open access software tools. In summary, the combined protocol strategy can be readily applied for quantitative TATS network studies during physiological myocyte adaptation or disease changes, comparison of different cardiac or skeletal muscle cell types, phenotyping of transgenic models, and pharmacological or therapeutic interventions.
En las células del músculo estriado sanos, estructuras de membrana tubulares con orientaciones "transversales" (T-túbulos) perpendiculares al eje de células principales son abundantes. En consecuencia, los túbulos T se han caracterizado como extensiones continuas de la célula muscular principal "lateral" membrana de la superficie (sarcolema), que penetran profundamente el citosol hacia el centro de la celda. El papel fisiológico de los túbulos T continuo con la membrana de la superficie exterior es el acoplamiento eléctrico rápido de los compartimentos intracelulares remotas formadas por dominios de contacto de orgánulos SER en todo el volumen relativamente grande de células del músculo cardiaco por acoplamiento de proximidad nanométrica de voltaje activado de tipo L de Ca 2 + canales (Cav1.2) corriente de entrada (I Ca) activación de los receptores de rianodina adyacente (RyR2) SER Ca 2 + comunicados. En miocitos ventriculares (VM), los contactos de membrana no continuos ("uniones") entre los dominios de unión de SER y T-tubules se cree que controlar miles de nanodominios liberación de Ca2 + intracelular individuales en cada celda 1.
Para cualquier dominio contacto dado, las porciones de membrana yuxtapuestos cada uno de los T-túbulos y el periférico (unión) SER son aproximadamente 15 nm cerca uno del otro, por lo tanto, se define como nanodomain. De esta manera, muy pequeñas subespacios citoplasmáticos individuales son segregados que permiten comportamientos compartimiento células autónomas cuasi. Cuando un potencial de acción entrante activa los canales Cav1.2 en los túbulos T de máquinas virtuales, una parte relativamente pequeña de Ca2 + hacia adentro corriente aumentará rápidamente el subespacio concentración de Ca2 + [Ca 2 +] S en el attoliter nanodomain tamaño 1. A continuación, la [Ca 2 +] S aumento de Ca2 + activa los receptores de rianodina -gated (RyR2) dentro de la proximidad del nanómetro en la unión entre la membrana SER yuxtapuesta, y este proceso de acoplamiento se produce a lo largo de toda pareja eléctricamented miocitos nanodominios. RyR2s producen racimos de múltiples canales como densas con una estequiometría estimado de 1 canal Cav1.2 durante 5-10 RyR2 canales 2. Desde la SER-a citosol [Ca 2 +] gradiente es muy empinada (relación 10 4: 1) y RyR2s funcionan como alta conductancia Ca 2 + canales de liberación de los clústeres funcionalmente acoplados, RyR2 activación resulta en una gran cuantitativamente Ca 2 + versión actual de T-túbulos junto dominios SER unión crecientes subespacial local de [Ca 2 +] S 100 M o superior dentro de 1-2 ms 3,4. Este comportamiento amplificación de la señal cardiaca también se conoce como Ca 2 + inducida por Ca 2 + en libertad (CICR). Tomados en conjunto, los túbulos T son esenciales estructuras de membrana que activan rápidamente las señales de liberación de Ca 2 + a través de contactos SER nanodomain de unión y CICR en toda la célula durante la excitación-contracción de acoplamiento (CE).
Además de los túbulos T, túbulo axials (A-túbulos) con una orientación significativamente diferente paralela a las principales (longitudinal) del eje de células han sido documentados por microscopía electrónica (EM), y estudios de microscopía confocal de 2 fotones. Por ejemplo, una red continua de toda la célula de A-túbulos entre miofibrillas interconectados con T-túbulos cerca sarcómero Z-líneas se demostró por trazadores extracelulares y EM imágenes de conejillo de indias fijo VM 5. Uso de la tinción con fluoresceína dextrano ligado extracelular y vivir de imágenes 2-fotón de rata máquinas virtuales, una red de túbulos 3D reticular complejo se visualizó que consiste en ~ 60% túbulos T y ~ 40% A-túbulos 6. Este estudio no sólo llevó a la visualización en 3D de abundantes A-túbulos, sino también a la comprensión de que el corte para la visualización EM está inherentemente limitado para el análisis de redes complejas y dinámicas de membrana como el sistema túbulo-transversal axial (TATS). En consecuencia, confocal imágenes de células vivas de las membranas TATS directamente manchada con di-8-ANNEPS fue desarrollado. Si de células vivasRedes TATS se analizaron por transformación de Fourier, el aspecto habitual de componentes túbulo-T en el espacio cerca del sarcómero líneas z se refleja en el espectro de potencia de conjunto de una región de señales estriados 7. Esta estrategia de análisis indirecto se ha utilizado para detectar cambios regionales en todo el componente de células en la regularidad TATS en modelos de enfermedad 7. Por ejemplo, shRNA mediada junctophilin-2 derribo provocó insuficiencia cardíaca y la deficiencia de proteína específica isoforma resultaron en reorganización T-túbulos con nanodomain Ca 2 + disfunción versión 8. Recientemente hemos ampliado el análisis de las redes de membrana TATS a través de enfoques cuantitativos directos y aún más por microscopia de super-resolución de células vivas de los componentes individuales en TATS ratón máquinas virtuales utilizando el agotamiento de la emisión estimulada (STED) nanoscopía 9. Resolución de imagen nanométrica permitido para el análisis directo de los componentes TATS individuo más pequeños, que se aproximan una distribución 50:50 de transversalfrente a las orientaciones del túbulo axiales, confirmando cuantitativamente dos componentes TATS abundantes todavía orientados diferencialmente individuales en corazones sanos ratón 9. Estas estrategias se describen con más detalle en la sección del protocolo de abajo.
Aunque el papel fisiológico de los abundantes componentes A-túbulos en el corazón adulto se ha mantenido enigmático, EM estudios han documentado estructuras de membrana SER asociados con A-túbulos que sugieren endógena Ca 2 + nanodominios liberación en cobaya y rata VMs 5,10. Confocal análisis de Cav1.2 y RyR2 encontró un alto grado de colocalización en las uniones A-túbulo 10. Desde ~ 20% de los espontáneos Ca 2 + chispas en rata VMs originó relativamente lejos de estrías Z-línea donde normalmente se producen túbulos T, un argumento ha sido que, efectivamente, pueden existir y funcionar nanodominios A-túbulo asociados como Ca 2 + sitios de liberación 11,12. Curiosamente, la formación de túbulos T-OC y la maduracióncurs sólo después del nacimiento y es paralelo al crecimiento de las células cardíacas, por ejemplo, a través de la brotación de invaginaciones del sarcolema precursor en P5 y inmadura ramificados asambleas red TATS en P10 en ratones 13. Parece que Junctophilin-2 es particularmente importante para la maduración postnatal red TATS desde shRNA knock-down impidió que el anclaje de las membranas de los túbulos T-SER a los cruces que conduce a un retraso en la liberación de Ca2 + y la organización TATS patológicas compatibles con arquitecturas inmaduros A-túbulo dominadas en VM 13. Estas observaciones pueden en última instancia conducir a una prueba de concepto de que los túbulos T se forman a través de procesos de invaginación de la membrana, mientras que A-túbulos pueden transformarse a través de mecanismos intracelulares adicionales o incluso alternativas 14.
Caracterización de TATS cambios de membrana en las enfermedades del corazón se ha convertido en un área de investigación importante para cuestiones fisiopatológicas. Los informes iniciales en un modelo canino de estimulación inducida failu corazónre mostraron una pérdida de túbulos T y actual Cav1.2 (I Ca) 15. Un modelo de cerdo de miocardiopatía isquémica demostraron una reducción de la densidad de los túbulos-T y una sincronía reducido intracelular de Ca 2 + en libertad 16. Utilizando un modelo de ratas espontáneamente hipertensas (SHR) de la insuficiencia cardíaca, una pérdida de túbulos T se asoció con una reducción de acoplamiento nanodomain de Cav1.2 y RyR2 por el mecanismo propuesto de "RyR2 orfandad" 7. Una pérdida de túbulos T también se ha demostrado en las VM humana a partir de muestras de miocardiopatía isquémica, dilatadas, hipertróficas y 17. Además, se informó de un aumento de la A-túbulos en secciones de tejido de miocardiopatía dilatada humana 18. A raíz de un infarto de miocardio, mostramos un mecanismo diferencial de TATS reorganización en ratón VM con disminuciones significativas de los túbulos T, en contraste con los aumentos de los componentes A-túbulo 9. Es importante destacar que, la mejora de contraste local de lograrse a través de la membrana de células vivas superresolución STED microscopía de activar el análisis de componentes cuantitativa detallada a través de mediciones directas, que mostraron una proliferación significativa de la A-túbulos con aumentos globales de la longitud de la red TATS y complejidad de ramificación 9. Además, se demostró que el entrenamiento físico puede revertir la remodelación T-túbulo en ratas después de infarto de miocardio 19 y que la terapia de resincronización cardiaca puede conducir a revertir la remodelación de los túbulos T en perros con insuficiencia inducida tachypacing fibrilación corazón 20. En conjunto, los estudios tanto en las intervenciones terapéuticas potenciales humano enfermo y animal máquinas virtuales, así como posiblemente se beneficiarán de los procedimientos de aislamiento de células de alta calidad y estrategias de análisis cuantitativos detallados como se indica en el protocolo y los resultados de las secciones a continuación.
Además, como se ha demostrado recientemente por superficie lateral frente TATS el tráfico de membrana de canal de KATP isoformas 21, es importante tener en cuenta m fibrilaciónyocytes (AMS) como biológicamente diferentes, así como comparativas modelo celular cardiaca frente a las máquinas virtuales. T-túbulos fueron recientemente documentados en ovejas y acompañamiento humano 22. La evidencia actual sugiere que existen pocos túbulos T en células de AM y normalmente en los mamíferos más grandes, como las ovejas y los seres humanos, pero no en los roedores pequeños 23. A diferencia de las máquinas virtuales, en los AM aparece intracelular de Ca 2 + liberación se produzca a partir de la propagación de la superficie celular por difusión hacia el centro de la celda que se traduce en marcado Ca espacial y temporal 2 + gradientes 23. Dentro de este marco parece importante dilucidar los mecanismos de Ca 2 + señalización intracelular inestabilidad de las formas de enfermedades comunes tales como la fibrilación auricular 24. En resumen, tanto el aislamiento de células AM y VM y cada uno de los corazones sanos y enfermos se emplean comúnmente protocolos. Sólo si el aislamiento de células se hace correctamente, a juzgar por la documentación microscópico de calidad suficiente de células, las muestras de AM y VM deben ser carried hacia adelante para el análisis cuantitativo TATS. Por consiguiente, las siguientes secciones de protocolo son críticamente dependientes de células de alta calidad aislados de ratón o de otras especies, seguido por microscopia de células vivas para analizar las membranas intactas TATS. Como se ha señalado anteriormente, la caracterización de membranas TATS es un área de investigación difícil, con una propensión a la fijación y preparación de artefactos 6, los cambios de la membrana debido a alteraciones osmóticos y limitaciones de la resolución de la microscopía de luz convencional 9. Tomamos nota de que los protocolos recientes del estado de la técnica para el aislamiento de los AM humanos de Ca 2 + de imágenes y patch-clamp y de rata máquinas virtuales para el cultivo celular se han publicado previamente en esta revista 25,26.
Aunque los miocitos cardiacos se han aislado y estudiado durante décadas 32, una revisión reciente concluyó que la alta calidad aislamientos de células miocitos consistentes siguen siendo difíciles 27. Esto refleja protocolos relativamente complejos para el aislamiento de los miocitos cardíacos primarios vis-à-vis la falta de enfoques estándar comunes, metadatos compartidos, y la documentación transparente de la calidad de la célula. Protocolos de aislamiento de células se suelen personalizarse por grupos individuales, producir resultados variables de la célula aislados, dependerá de la configuración de modelo individuales (por ejemplo, especies, edad, coexisten enfermedades del corazón), y por lo general se ajustan a determinadas condiciones experimentales. En el contexto de la TATS cuantitativa estudios de membrana y protocolos presentados aquí, un nivel esencial de la evaluación y documentación de la calidad se refiere a la confocal o microscopía de super-resolución de las estructuras de membrana de células individuales propensas a metabólicas y protocolo de aislamiento de los cambios dependientes, tantoen AM o VM. Es importante destacar que, aunque los altos rendimientos de los aislados de células intactas sugieren miocitos sanos, los investigadores tienen que documentar y juzgar críticamente cada célula individual cuidadosamente frente a los criterios morfológicos de superficie y TATS integridad de la membrana frente a daños no específicos debido a los procedimientos de aislamiento frente a los cambios específicos debido a diferentes tipos de las intervenciones, en comparación con las condiciones de control. Una variable importante durante el aislamiento célula cardíaca es la actividad específica de un lote de colagenasa dado. Para seleccionar un nuevo lote de colagenasa, la actividad enzimática de varias muestras de colagenasa se debe probar uno contra el otro mediante la evaluación de rendimiento de miocito cardiaco y la calidad, y de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Lo ideal sería que un nuevo lote de colagenasa se identifica con la actividad colagenasa similar a anteriores lotes utilizados con éxito (por extensión de la evaluación de las posibles actividades enzimáticas se refieren a la "herramienta de selección mucho colagenasa" en la tabla de materiales y métodos). TAken juntos, los enfoques cuantitativos de la visualización de la membrana TATS dependen críticamente de la calidad del aislamiento de células y, viceversa, aislamientos de células cardíacas que conducen a daño de la membrana no específico tal como se documenta por TATS microscopía deben dar lugar a la revisión crítica y la corrección de los procedimientos de aislamiento. Dado que la calidad de aislamiento de células y la visualización de la membrana TATS y cuantificación están intrínsecamente ligados, los protocolos descritos en este artículo abarcan todos los aspectos importantes, como una estrategia continua.
Un reto adicional y tema común de los estudios cardíacos, daño celular y / o la pérdida de células se producen debido a las intervenciones que comprometen metabólicamente por ejemplo, a raíz de un infarto de miocardio 9, sin embargo, tienen que ser juzgados contra posibles daños, por ejemplo inadvertida, tras la embolia gaseosa desapercibido durante el aislamiento celular. El aislamiento de los miocitos cardíacos de corazones enfermos puede conducir a la pérdida de células significativa adicional y la disminución de los rendimientos celulares. Por lo tanto, ComparIson del número total de células intactas aisladas entre el control y corazones enfermos puede ser significativo si el aislamiento de células y el recuento se aplican de manera coherente a través de protocolos estandarizados. En consecuencia, es crítico para juzgar la integridad celular a través de un grupo de control apropiado, que refleja la mejor calidad posible de los miocitos de aislamiento de células. Es importante destacar que, la calidad célula individual y microscopía de células vivas de sanos frente a enfermo frente miocitos inadvertidamente dañados por el procedimiento de aislamiento pueden influir significativamente en el análisis de redes TATS de membrana. Los protocolos que aquí se presentan, por tanto, hacen hincapié en la integridad y la estabilidad de los componentes de la membrana fisiológicos durante el aislamiento celular y microscopía de células vivas de las membranas intactas. Todo el flujo de trabajo está diseñado como una estrategia continua para lograr y mantener componentes de la membrana TATS intactas mientras que excluye las células dañadas, ya que estos exhibirán aislamiento artefactos dependientes de membrana como túbulos de membrana interrumpidos, Membrane ampollas y redes TATS alterados erróneamente bajo condiciones de control y comprometer aún más el análisis cuantitativo. A la inversa, las mismas estrategias son cruciales para los estudios de intervención con el potencial de romper las membranas TATS, que dependen críticamente de los controles comparativos significativos entre verdad sana frente a la verdadera célula enferma con TATS cambios de membrana.
Además, nos ocupamos de los procedimientos para lograr el aislamiento técnicamente mucho más difícil de las células de AM. A pesar de los avances y protocolos mejorados, es importante hacer hincapié en que no es trivial reproducir aislamientos de células de alta calidad de las máquinas virtuales y aún menos fiable para los AM. Esto es debido a que el rendimiento global menor de células AM donde incluso pequeños errores o variaciones durante el aislamiento de células puede conducir a un fallo completo de aislamiento de células AM, mientras que un grado leve de daño celular VM puede ser menos aparente en suspensión de células debido a la relativamente alta de células números en comparación con AM. Dado que las células AM podrían convertirse en curved después del aislamiento, el análisis a través de varias regiones de interés puede ser ventajoso como se indica en el paso 4.3. Siguiendo un procedimiento detallado de las medidas de aislamiento de células, proporcionamos un protocolo para la tinción directa integral de membrana y confocal o STED imágenes de super-resolución de las redes TATS tanto para las máquinas virtuales y los AM. Estos protocolos permiten tanto el análisis cuantitativo y la diferenciación de ciertos componentes de las membranas TATS través de parámetros previamente establecidos. En comparación con máquinas virtuales, la organización 3D y comportamientos funcionales de la red TATS auricular en AMs son actualmente menos comprendidos.
Los procedimientos a membranas imagen TATS en células vivas (pasos 3.1 a 3.7) se desarrollaron con confocal comercial (Tabla de Materiales / Equipos) y STED microscopios de fluorescencia medida 9. Para optimizar los ajustes del microscopio para la generación de imágenes de fluorescencia y el análisis cuantitativo TATS, los siguientes puntos son de importancia general:
En contraste con las estrategias de análisis directos presentados aquí, publicaciones anteriores que describen membranas TATS y los cambios relacionados con la enfermedad, han utilizado lecturas agregados regionales de densidad de T-túbulos como estrategia cuantitativa 16,17, o estrategias regionales indirectos basado en Fourier transformación análisis de las señales de membrana estriadas a fin de evaluar la regularidad componente túbulo T-7. En contraste, los enfoques cuantitativos descritos aquí están directamente relacionados con los componentes individuales TATS y ofrecen una serie de parámetros adicionales, incluyendo las propiedades de red de membranas y componentes específicos, como el porcentaje de los A-túbulos. Además, la densidad de la red TATS se puede cuantificar como la longitud normalizada de todo el esqueleto extraído por área ROI. El número de uniones triples de tres individual, componentes tubulares conectados continuamente se puede utilizar como una medida de la complejidad de ramificación de la red de membrana TATS. Tomamos nota de que cualquier análisis de componentes TATS más pequeños depende de los procedimientos de tinción. En nuestra experiencia, 800 l de una solución de di-8-ANEPPS 50 M son suficientes para teñir las redes TATS completos en un sedimento celular que contiene 50.000 células VM 9. Sin embargo, si el sedimento celular contiene un menor número de miocitos cardíacos, Si los detectores de fluorescencia potentes están disponibles, y si la imagen confocal de la distribución global de la red TATS más que detalles más pequeños de la membrana y los cambios cuantitativos son de interés, menores concentraciones de colorante puede ser utilizado en base a pruebas empíricas. Finalmente, una macro software escrito para el análisis descrito se puede utilizar para automatizar los pasos de procesamiento de imágenes para facilitar el análisis de grandes conjuntos de datos, que es particularmente útil para la comparación entre los diferentes grupos de tratamiento (por ejemplo, fármacos), tipos de células (por ejemplo, AM contra VM ), y las intervenciones fisiopatológicos (por ejemplo, el tratamiento simulado contra el infarto de miocardio).
Para el análisis de imagen de las redes TATS, la siguiente secuencia de pasos principio se aplica: 1) balanceo de la bola de fondo-resta (4.5.1) para eliminar las variaciones espaciales en la intensidad de fondo; 2) aumento del contraste local (4.5.2).; 3) de suavizado de imagen (4.5.3); 4) Región estadística fusión (4.5.4); 5) que define elumbral de binarización de la imagen (4.5.6); y 6) el cálculo de los datos de esqueleto (4.5.8). Un paso crítico durante la esqueletización de imágenes TATS fluorescentes es la binarización de la imagen mostrada en la Figura 6. Los pasos de umbrales asociados definen en última instancia el que se detectan verdaderas estructuras de membrana para representar los componentes subyacentes frente TATS estructuras potencialmente falsos identificados por error del ruido de fondo. Identificación de la correcta umbral para el análisis de imagen binaria debe corresponder con los verdaderos TATS estructuras de membrana, que depende de un (SNR) para cada uno de los enfoques de microscopía confocal y de superresolución suficientemente alta de señal a ruido. Por lo tanto, una calidad de imagen suficiente se debe establecer en primer lugar y, posteriormente, junto con el criterio fundamental de la calidad celular individual, incluida la documentación por imágenes de campo claro como se indica. Las opciones alternativas para adaptar el protocolo de segmentación de imágenes para una salida dada datos microscopio y / o educación físicapreguntas IOLÓGICA incluyen deconvolución imagen y otros procedimientos de fijación de umbrales como "Otsu" o "Iso-datos" disponibles como plugins ImageJ. Independientemente del procedimiento de segmentación definitiva, consideramos que la comparación entre los datos extraídos y primas por superposición de imágenes de una etapa de control de calidad obligatorio. En resumen, la integridad morfológica y la membrana de los miocitos aislados individuales, tinción suficiente de las membranas intracelulares TATS, la optimización de parámetros para imágenes de fluorescencia, y control de superposición de los datos extraídos esqueleto, contribuirán a la calidad de las imágenes TATS fluorescentes y resultados cuantitativos.
Si se utilizan especies más grandes que el ratón para el aislamiento de células, los protocolos pueden adaptarse fácilmente según sea apropiado. Durante los siguientes especies más grandes, corazones de rata pueden ser canulados con un objeto contundente 14 G cánula (diámetro exterior 2,1 mm) y se perfundieron a 8 ml / min. Significativamente mayores o enfermos corazones pueden requerir tamaños de cánulas más grandes. En genral, la perfusión cardíaca puede llevarse a cabo ya sea por la presión constante, por ejemplo, utilizando una columna de agua de alta 1 m entre el depósito y la aorta o por la constante de flujo usando una bomba peristáltica. Para el aislamiento de células a partir de pequeños corazones de roedores como ratones y ratas de flujo constante puede ser ventajoso ya que la digestión de colagenasa eventualmente interrumpir los vasos de resistencia coronaria que conducen a tasas de perfusión excesivas fugas de camas de los vasos que se van a controlar en cierta medida por los protocolos de flujo constantes. En contraste, la presión de perfusión constante es ventajoso si la supervisión de la velocidad de flujo y la canulación correcta son una prioridad, que es ventajosa para los modelos de intervención con sangre alteradas comportamientos de resistencia buque, así como para la formación de los procedimientos de aislamiento de células.
Como se indica anteriormente, la calidad suficiente de células es muy importante para los estudios cuantitativos de los sistemas de membrana endógenos. Sin embargo, durante la perfusión del corazón y la digestión de colagenasa numerosos factores pueden critically afectan a la calidad del aislamiento de células, que nunca debe ser subestimada durante la optimización de protocolo o la solución de problemas 27. En particular, la actividad de un lote de colagenasa dado debe determinarse para el tejido específico de interés, por ejemplo, aurículas o los ventrículos antes de la ejecución de los estudios de buena fe experimentales para establecer condiciones de aislamiento que se mantiene durante todo el resto del estudio. Por otra parte, la calidad del agua, el pH, la temperatura, la optimización y limpieza de la configuración de perfusión minimizarán el riesgo de daño accidental de los contaminantes y las embolias, y posibles factores adicionales que seguir de establecer condiciones óptimas homeostáticos durante el aislamiento celular. BDM (2,3-butanodiona-monoxima) un inhibidor reversible de la miosina ATPasa puentes cruzados se usa comúnmente durante la disección del tejido y la digestión para sostener la relajación del músculo cardíaco, lo que aumenta el rendimiento de aislamientos de células. Sin embargo, los investigadores necesitan to ser consciente de que BDM puede ejercer actividades de las fosfatasas no específicas que conducen a efectos fuera de la meta, por ejemplo, la inhibición de la Na + / Ca 2 + corrientes de cambio en determinadas condiciones 33. Para algunos experimentos que podría ser ventajoso sustituir BDM por blebbistatin como solución cardiopléjica, un inhibidor con una alta afinidad por la miosina a concentraciones micromolares que es, sin embargo, tóxico y relativamente caro y puede tener otros efectos fuera de objetivo. Descansar cardiomiocitos sanos no deben mostrar ningún contracciones en ausencia de estimulación eléctrica y estas células deben ser excluidos de los nuevos análisis. Por otra parte, la contracción de los miocitos cardíacos y la relajación en respuesta a la estimulación eléctrica en fisiológicos extracelulares concentraciones de Ca 2 + puede ser utilizado para establecer el comportamiento contráctil normal como una medida adicional para evaluar la calidad de células funcionales y / o comportamiento anormal en la enfermedad cardíaca versus control sano células.
<p class="Jove_content"> En resumen, los protocolos para el aislamiento de células individuales y análisis de imagen cuantitativo descrito aquí se ha aplicado con éxito para la microscopía confocal y de super-resolución de la red de membrana TATS en VM 9 y AM 21 células, así como para el análisis cuantitativo de las redes de microtúbulos en miocitos cardíacos fijos (datos no presentados). Estas y futuras aplicaciones de los protocolos puede abrir vías para una variedad de preguntas experimentales tales como la caracterización de membranas TATS en diferentes etapas de desarrollo o el análisis de las proteínas o de orgánulos estructuras asociadas a la membrana que hacen contacto con la red TATS ejercer muy localizados, la señalización de dominio específico funciones en las células de AM y VM.The authors have nothing to disclose.
This work received support through Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB 1002 (subprojects A05 and B05 to S.E.L.) and KFO 155 (subproject 4 to S.E.L.), a Halbach Foundation award to S.E.L. supporting E.W.; a grant from the German Cardiac Society to S.B.; and a DAAD exchange program supporting T.K. as visitor at the University of Maryland. The research leading to these results has received funding from the European Community’s Seventh Framework Program FP7/2007-2013 under grant agreement No. HEALTH-F2-2009-241526, EUTrigTreat (to S.E.L.). S.E.L. is a principal investigator of the German Center of Cardiovascular Research (DZHK).
Chemicals and enzymes | |||
2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich, Munich, Germany | B0753 | |
Bovine calf serum | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | SH30073 | Triple 0.1 µm sterile filtered. |
CaCl2 | Sigma-Aldrich, Munich, Germany | 21115 | Diluted 1:10 in MQ water to obtain 100 mM CaCl2 stock concentration. |
Collagenase type II | Worthington via Cell Systems, Troisdorf, Germany | on request | Enzymatic activity depends on individual collagenase batches. Collagenase II and other enzyme activities (Caseinase, Clostripain, Tryptic) can be assessed in the "collagenase lot selection tool". Determine cell yield and quality individually for each new lot of collagenase. |
Glucose | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | HN06.1 | |
Heparin | Rotexmedica, Trittau, Germany | PZN-03862340 | Diluted in 0,9 % NaCl and injected subcutaneuosly in abdominal skin. |
HEPES | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 9105.4 | |
Forene 100% (V/V) | Abbott, Libertyville, IL, USA | B506 | Active agent: isoflurane, 250 ml. Use approximately 2 Vol% in air/oxygen dispenser instrument. |
KCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 6781.3 | |
KH2PO4 | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3904.2 | |
Laminin (2 mg/ml) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 354232 | Lamination is described under step 2.1. |
MgCl2 · 6 H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 2189.2 | |
MgSO4 · 7 H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8283.2 | |
Na2HPO4 · 2 H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4984.2 | |
NaHCO3 | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | HN01.1 | |
Taurin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4721.2 | |
Dyes | |||
Di-8-ANEPPS | Molecular Probes, Life Technologies, Darmstadt, Germany | D-3167 | Stock solution 2 mM in DMSO |
Trypan blue | Sigma-Aldrich, Munich, Germany | T8154 | Trypan blue is gently mixed 1:1 via tip-cut 1 ml plastic pipette with cell suspension prior to cell counting in Neubauer cytometer. |
Langendorff perfusion setup | |||
Circulation thermostat | Lauda, Lauda-Königshofen, Germany | Please refer to Louch et al. (JMCC 2011). Heat up thermostat und buffers in perfusion tubing to 37 °C 15 min prior to use. | |
Flexible silicone tubing Tygon for peristaltic pump | VWR, Darmstadt, Germany | 224-2252 | Tubing needs to be changed regularly. |
Flexible silicone tubing Tygon for thermostat | VWR, Darmstadt, Germany | 228-4340 | |
Heating coil surroundung perfusion tubing | Rettberg, Göttingen, Germany | custom-made | Heating coil and tubing needs to be cleaned thoroughly via MQ water after using. Do not use detergents. Glass components should be bathed regularly in 10 mM NaOH overnight. |
Peristaltic pump | Ismatec, Wertheim, Germany | ISM830 | |
Three way stop cock Discofix C Luer Lock 10 cm | Braun, Melsungen, Switzerland | 16500C | |
Three way stop cock Discofix 3SC | Braun, Melsungen, Switzerland | 4095146 | |
Instruments | |||
42 mm glass coverslips | Menzel Gläser via Thermo Scientific, Schwerte, Germany | on request | 0.13 – 0.16 mm thickness |
Cannula 21G | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lake, NY, USA | 304432 | Cut to a length of ~ 5 mm, roughened with sandpaper. |
Coverslips for Neubauer cytometer 24 x 24 mm | Menzel Gläser via Thermo Scientific, Schwerte, Germany | on request | 0.38 – 0.42 mm thickness |
Graefe forceps, 0.5 mm tips, slight curve | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11151-10 | |
LSM 710 NLO | Carl Zeiss, Jena, Germany | 63x 1.4 NA oil objective | |
Neubauer improved cytometer | Labor Optik, Friedrichsdorf, Germany | 1100000 | Counting procedure: Wipe cytometer and coverslip provided with the counting chamber with 70 % ethanol. Press coverslip gently on the counting chamber so that the two glass surfaces are in contact and Newton's rings can be observed. Subsequently, 10 – 20 µl cell suspension can be applied to the edge of the coverslip to be sucked into the void by capillary action. Count the intact vs. defect myocytes using the squares of the cytometer grid which reflects 100 nl. Repeat counting procedure on the second grid provided on the cytometer. Calculate the density of cells in your original cell suspension by taking account of any dlutions and counting shortcuts. |
POC-R2 Imaging Chamber | Pecon, Erbach, Germany | Cell suspension volume: 800 µl; desired plating density: ~ 1000 AM and ~ 10,000 VM | |
Spring scissors, 8 mm blades straight, blunt | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 15025-10 | |
Student dumont #7 forceps, inox | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 91197-00 | |
Student iris scissors, curved, 11.5 cm | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 91461-11 | |
Student iris scissors, straight, 11.5 cm | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 91460-11 | |
Student surcigal scissors, straight, sharp, 12 cm | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 91402-12 | |
Tissue forceps, 1×2 teeth, slim, 10 cm | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11023-10 |