في myocytes القلب، والهياكل غشاء أنبوبي تشكل شبكات داخل الخلايا. وصفنا الأمثل بروتوكولات لط) عزلة myocytes من الماوس القلب بما في ذلك مراقبة الجودة، والثاني) تلطيخ الخلايا الحية للدولة من بين الفن مضان المجهري، والثالث) تحليل صورة مباشرة لقياس مدى تعقيد مكون واللدونة من غشاء الخلايا الشبكات.
In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules – the transverse-axial tubule system (TATS) – controls deep intracellular signaling functions. While the outer surface membrane and associated TATS membrane components appear to be continuous, there are substantial differences in lipid and protein content. In ventricular myocytes (VMs), certain TATS components are highly abundant contributing to rectilinear tubule networks and regular branching 3D architectures. It is thought that peripheral TATS components propagate action potentials from the cell surface to thousands of remote intracellular sarcoendoplasmic reticulum (SER) membrane contact domains, thereby activating intracellular Ca2+ release units (CRUs). In contrast to VMs, the organization and functional role of TATS membranes in atrial myocytes (AMs) is significantly different and much less understood. Taken together, quantitative structural characterization of TATS membrane networks in healthy and diseased myocytes is an essential prerequisite towards better understanding of functional plasticity and pathophysiological reorganization. Here, we present a strategic combination of protocols for direct quantitative analysis of TATS membrane networks in living VMs and AMs. For this, we accompany primary cell isolations of mouse VMs and/or AMs with critical quality control steps and direct membrane staining protocols for fluorescence imaging of TATS membranes. Using an optimized workflow for confocal or superresolution TATS image processing, binarized and skeletonized data are generated for quantitative analysis of the TATS network and its components. Unlike previously published indirect regional aggregate image analysis strategies, our protocols enable direct characterization of specific components and derive complex physiological properties of TATS membrane networks in living myocytes with high throughput and open access software tools. In summary, the combined protocol strategy can be readily applied for quantitative TATS network studies during physiological myocyte adaptation or disease changes, comparison of different cardiac or skeletal muscle cell types, phenotyping of transgenic models, and pharmacological or therapeutic interventions.
في خلايا العضلات المخططة الصحية والهياكل غشاء أنبوبي مع توجهات "عرضية" (T-الأنابيب) عمودي على محور الخلية الرئيسية هي وفيرة. وبناء على ذلك، اتسمت T-الأنابيب والتمديدات مستمرة من الخلايا العضلية الرئيسي "الجانبي" غشاء السطحية (غمد الليف العضلي)، التي تخترق بعمق العصارة الخلوية نحو مركز الخلية. دور الفسيولوجية T-الأنابيب مستمرة مع غشاء السطح الخارجي هو اقتران الكهربائي السريع من المقصورات داخل الخلايا النائية التي شكلتها مجالات الاتصال SER عضية في جميع أنحاء حجم الخلايا العضلية القلبية كبير نسبيا النانومترية اقتران قرب تنشيط الجهد L-نوع كا 2+ قنوات (Cav1.2) الحالي إلى الداخل (أنا كا) المجاور ryanodine تفعيل مستقبلات (RyR2) SER الكالسيوم 2+ الإصدارات. في myocytes البطين (نظام رصد السفن)، والاتصالات غشاء غير مستمرة ("تقاطعات") بين المجالات موصلي SER وTويعتقد -tubules للسيطرة على آلاف من الخلايا الفردية nanodomains الكالسيوم 2+ الافراج عنه في كل خلية 1.
لأي مجال الاتصال معين، الأجزاء غشاء جنبا إلى جنب كل من T-أنبوب صغير والمحيطي (صلي) SER ما يقرب من 15 نانومتر قريبة من بعضها البعض، وبالتالي يعرف بأنه nanodomain. وبالتالي، يتم فصل الفضاءات الجزئية هيولي الفردية الصغيرة جدا التي تمكن السلوكيات شبه مقصورة خلايا مستقلة. عندما ينشط إمكانات العمل الواردة قنوات Cav1.2 في T-الأنابيب من نظام رصد السفن، والكالسيوم صغير نسبيا 2+ الداخل سوف يزيد التيار بسرعة فضاء جزئي الكالسيوم 2+ تركيز [كا 2+] S في attoliter الحجم nanodomain 1. بعد ذلك، [كا 2+] الزيادة S ينشط الكالسيوم 2+ ryanodine المستقبلات -gated (RyR2) داخل القرب نانومتر في جنبا إلى جنب تقاطع غشاء SER، وتحدث هذه العملية في جميع اقتران زوجين كهربائياد nanodomains العضلية. تحدث RyR2s كثيفة ومجموعات متعددة القنوات مع رياضيات الكيمياء تقدر ب 1 قناة Cav1.2 لمدة 5-10 قنوات RyR2 2. منذ-SER-إلى العصارة الخلوية [كا 2+] التدرج هو حاد جدا (نسبة 10 4: 1) وRyR2s تعمل كما تصرف عالية، كا 2+ القنوات الافراج في مجموعات إلى جانب وظيفيا، RyR2 النتائج في تنشيط الكالسيوم كبير كميا 2+ الإصدار الحالي من T-أنبوب صغير إلى جانب موصلي المجالات SER زيادة فضاء جزئي المحلي [كا 2+] S إلى 100 ميكرومتر أو أعلى في غضون 1-2 مللي ثانية 3،4. ويشار إلى هذا السلوك القلب التضخيم إشارة أيضا إلى ما كا كا 2+ يسببها 2+ اطلاق سراح (CICR). أخذت معا، T-الأنابيب والهياكل غشاء الأساسية التي تنشط بسرعة الإفراج إشارات الكالسيوم 2+ من خلال صلي الاتصالات nanodomain SER واسعة خلية CICR خلال الإثارة، تقلص (EC) اقتران.
بالإضافة إلى T-الأنابيب، أنبوب صغير المحوريوقد تم توثيق ق (A-الأنابيب) مع مواز اتجاه مختلف إلى حد كبير في (الطولية) محور الخلية الرئيسية التي المجهر الإلكتروني (EM)، والدراسات متحد البؤر المجهر 2 الفوتون. على سبيل المثال، تبين وجود شعرية على مستوى خلية المستمر لالأنابيب بين اللييفات العضلية مترابطة مع T-الأنابيب بالقرب قسيم عضلي Z-خطوط استشفاف من خارج الخلية وEM التصوير من خنزير غينيا الثابتة نظام رصد السفن 5. استخدام خارج الخلية المرتبطة ديكستران فلوريسئين تلطيخ والعيش التصوير 2 الفوتون من الفئران نظام رصد السفن، وتصور على شبكي معقد شبكة 3D أنبوب صغير يتكون من ~ 60٪ T-الأنابيب و~ 40٪ A-6 الأنابيب. هذه الدراسة لم يؤد فقط إلى التصور 3D وفيرة من A-الأنابيب، ولكن أيضا إلى إدراك أن باجتزاء لEM التصور محدودة بطبيعتها لتحليل الشبكات المعقدة والديناميكية غشاء مثل نظام نبيب-عرضية المحوري (TATS). بالتالي، متحد البؤر تصوير الخلايا الحية أغشية TATS ملطخة مباشرة مع دي-8-ANNEPS تم تطويره. إذا الخلية الحيةويتم تحليل الشبكات TATS من التحول فورييه، وينعكس على المظهر المنتظم لمكونات-T أنبوب صغير في الفضاء القريب قسيم عضلي Z-خطوط من طيف الطاقة الفرقة من منطقة الإشارات المخططة 7. وقد استخدمت هذه الاستراتيجية غير المباشرة تحليل للكشف عن تغيرات على مستوى الخلية الإقليمية في TATS عنصر الانتظام في نماذج الأمراض 7. على سبيل المثال، تسبب shRNA بوساطة junctophilin-2 تدق إلى أسفل أدى قصور القلب ونقص بروتين معين في شكل الإسوي T-أنبوب صغير مع إعادة تنظيم nanodomain الكالسيوم 2+ الإفراج الخلل 8. فإننا قمنا بمد مؤخرا تحليل الشبكات غشاء TATS من خلال نهج الكمية المباشرة ومزيد من الحي المجهري superresolution خلية من مكونات TATS الفردية في نظام رصد السفن باستخدام الماوس حفز نضوب الانبعاثات (STED) nanoscopy 9. دقة الصورة النانومترية يسمح للتحليل المباشر من مكونات أصغر TATS الفردية، التي تقارب توزيع 50:50 من عرضيةمقابل توجهات أنبوب صغير المحورية، مؤكدا كميا عنصرين TATS وفيرة بعد الموجهة تفاضلي الفردية في قلوب الماوس صحية 9. وسيتواصل هذه الاستراتيجيات المبينة في القسم بروتوكول أدناه.
بينما ظل دور الفسيولوجية للعناصر A-أنبوب صغير وفيرة في قلب الكبار ملغز، وقد وثقت الدراسات EM الهياكل غشاء SER المرتبطة A-الأنابيب مما يشير الذاتية الكالسيوم 2+ nanodomains الافراج عنه في خنزير غينيا والجرذان نظام رصد السفن 5،10. وجد تحليل متحد البؤر من Cav1.2 وRyR2 درجة عالية من colocalization عند التقاطعات A-10 أنبوب صغير. منذ ~ 20٪ من الكالسيوم عفوية 2+ الشرر في الفئران نظام رصد السفن نشأت نسبيا بعيدا عن التصدعات خط Z-حيث تحدث T-الأنابيب عادة، كانت وسيطة واحدة أن nanodomains A-أنبوب صغير المرتبطة قد تكون موجودة في الواقع وظيفة الكالسيوم 2+ مواقع الإفراج 11،12. ومن المثير للاهتمام، وتشكيل T-أنبوب صغير ونضوج OCالأوغاد فقط بعد الولادة ويوازي نمو خلايا القلب، على سبيل المثال، من خلال تبرعم الانغلافات السلائف sarcolemmal في P5 وغير ناضجة تشعبت المجالس شبكة TATS في P10 في الفئران 13. يبدو أن Junctophilin-2 أهمية خاصة للبعد الولادة نضوج شبكة TATS منذ shRNA تدق إلى أسفل منع رسو الأغشية T-أنبوب صغير إلى تقاطعات SER مما يؤدي إلى تأخر الكالسيوم 2+ إطلاق وتنظيم TATS المرضية بما يتفق مع أبنية غير ناضجة A-أنبوب صغير تهيمن في نظام رصد السفن 13. هذه الملاحظات قد تؤدي في النهاية إلى إثبات صحة مفهوم أن T-الأنابيب تشكل من خلال عمليات انغلاف الغشاء حين A-الأنابيب قد يتحول داخل الخلايا من خلال آليات إضافية أو بديلة حتى 14.
أصبح توصيف التغييرات غشاء TATS في أمراض القلب مساحة البحثية الهامة للأسئلة المرضية في جسم المريض. التقارير الأولية في نموذج كلب من الناجم عن سرعة القلب failuإعادة أظهرت فقدان T-الأنابيب وCav1.2 التيار (I كاليفورنيا) 15. نموذج الخنازير من اعتلال عضلة القلب الدماغية أظهرت خفض كثافة-T أنبوب صغير وتزامن انخفاض الكالسيوم داخل الخلايا 2+ الافراج عن 16. باستخدام نموذج الفئران ارتفاع ضغط الدم بشكل عفوي (SHR) من قصور في القلب، كان مرتبطا فقدان T-الأنابيب مع انخفاض اقتران nanodomain من Cav1.2 وRyR2 بواسطة الآلية المقترحة من "RyR2 اليتم" 7. كما أظهرت فقدان T-الأنابيب في نظام رصد السفن البشري من الدماغية، المتوسعة، واعتلال عضلة القلب الضخامي عينات 17. وعلاوة على ذلك، أفيد زيادة في A-الأنابيب في أقسام الأنسجة من تمدد عضلة القلب البشري 18. بعد احتشاء عضلة القلب، أظهرنا آلية التفاضلية للTATS إعادة التنظيم في نظام رصد السفن الماوس مع انخفاض كبير من T-الأنابيب في المقابل إلى زيادة مكونات A-أنبوب صغير 9. الأهم، وتحسين النقيض غشاء المحلي يتحقق من خلال superre الخلية الحيةحل STED المجهري تمكين تحليل مفصل المكون الكمي من خلال القياسات المباشرة، والتي أظهرت انتشار كبير من A-الأنابيب مع الزيادات العامة للطول شبكة TATS والمتفرعة تعقيد 9. وعلاوة على ذلك، تبين أن التدريبات قد عكس إعادة T-أنبوب صغير في الفئران بعد احتشاء عضلة القلب 19 وأن العلاج إعادة المزامنة القلب قد يؤدي إلى عكس إعادة تشكيل T-الأنابيب في الكلاب مع الأذيني tachypacing الناجم عن قصور القلب 20. أخذت معا، فإن الدراسات سواء في التدخلات العلاجية المحتملة المريضة الإنسان والحيوان نظام رصد السفن وكذلك يمكن القول أن تستفيد من إجراءات عزل خلية عالية الجودة واستراتيجيات التحليل الكمي مفصلة على النحو المبين في البروتوكول والنتائج الأقسام التالية.
وعلاوة على ذلك، كما تبين مؤخرا من السطح الجانبي مقابل TATS الاتجار غشاء قناة KATP الأشكال الإسوية 21، فمن المهم النظر م الأذينيyocytes (AMS) تمييزا بيولوجيا وكذلك المقارن نموذج خلية قلبية مقابل نظام رصد السفن. وقد تم توثيق T-الأنابيب مؤخرا في الأغنام والبشري AMS 22. تشير الدلائل الحالية التي القليلة T-الأنابيب موجودة في الخلايا وAM عادة في الثدييات الكبيرة مثل الأغنام والبشر، ولكن ليس في القوارض الصغيرة 23. على النقيض من نظام رصد السفن، في AMS يبدو الكالسيوم داخل الخلايا الافراج 2+ تحدث من التكاثر سطح الخلية عن طريق الانتشار نحو مركز الخلية مما يؤدي إلى تميز كا المكاني والزماني 2+ التدرجات 23. في هذا الإطار يبدو من المهم لتوضيح آليات الكالسيوم داخل الخلايا مما يشير إلى عدم الاستقرار 2+ لأشكال المرض شيوعا مثل الرجفان الأذيني 24. باختصار، كل من وAM VM زنزانة انفرادية وكل القلوب السليمة والمريضة وتستخدم عادة البروتوكولات. إلا إذا تم عزل خلية بشكل صحيح كما تقرره الوثائق مجهرية من الخلايا جودة كافية، يجب أن تكون وAM VM عينات كاليفورنياrried قدما للتحليل الكمي TATS. وفقا لذلك، تعتمد بشكل حاسم على خلية عالية الجودة ويعزل من الماوس أو الأنواع الأخرى تليها المجهري الخلايا الحية لتحليل أغشية TATS سليمة الأقسام بروتوكول التالية. كما أشار سابقا، وتوصيف الأغشية TATS هو مجال البحوث صعوبة مع ميل لتثبيت وإعداد التحف 6، والتغيرات الغشاء بسبب التغيرات الأسموزية، والقيود قرار التقليدية المجهر الضوئي 9. نلاحظ أن الأخيرة دولة من بين الفن بروتوكولات لعزل AMS الإنسان لكا 2+ التصوير والتصحيح، المشبك والفئران نظام رصد السفن لزراعة الخلايا وقد نشرت سابقا في هذه المجلة 25،26.
على الرغم من myocytes القلب وقد تم عزل ودرس على مدى عقود 32، خلص استعراض أجري مؤخرا أن تتفق عالية الجودة العزلة الخلية العضلية لا تزال صعبة 27. وهذا يعكس بروتوكولات معقدة نسبيا لعزل myocytes القلب الأولية وجها لوجه انعدام النهج القياسية المشتركة، الفوقية المشتركة، وشفافة الوثائق جودة الخلية. عادة ما يتم تخصيص بروتوكولات العزل الخلية من قبل الجماعات الفردية، وتحقيق نتائج مختلفة من الخلايا المعزولة، تعتمد على الإعدادت في نموذج الفردية (مثل الأنواع والعمر وتتعايش أمراض القلب)، ويتم تعديل عادة لظروف تجريبية معينة. ضمن سياق TATS الكمي والدراسات المقدمة الغشاء والبروتوكولات هنا، على مستوى أساسي من تقييم نوعية وثائق تتعلق متحد البؤر المجهري أو superresolution الفردية الهياكل غشاء الخلية عرضة للالأيضية وبروتوكول العزلة تعتمد التغييرات، سواءفي AM أو VM. الأهم من ذلك، حتى لو عوائد عالية من العزلات خلية تشير myocytes صحية سليمة، يحتاج الباحثون لتوثيق وحكم بالغة كل خلية فردية بعناية ضد المعايير المورفولوجية السطحية وTATS سلامة غشاء مقابل الضرر غير محددة بسبب إجراءات العزل مقابل تغييرات محددة بسبب أنواع مختلفة التدخلات مقارنة للسيطرة على الأوضاع. متغير مهم خلال عزل خلايا القلب هو نشاط محدد من الكثير كولاجيناز معين. لتحديد الكثير من كولاجيناز الجديد، ينبغي اختبار النشاط الأنزيمي من عدة عينات كولاجيناز ضد بعضها البعض من خلال تقييم العائد العضلية القلبية والجودة، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. من الناحية المثالية، يتم التعرف على الكثير الجديد من كولاجيناز مع نشاط مماثل كولاجيناز إلى الكثير استخدمت بنجاح السابقة (لتقييم موسع للأنشطة انزيم الممكنة الرجوع إلى "كولاجيناز الكثير أداة التحديد" في جدول المواد والأساليب). Tتناوله معا، والنهج الكمية لTATS التصور غشاء تعتمد بشكل حاسم على نوعية الخلايا والعزلة، بالعكس، العزلة خلية القلب مما يؤدي إلى تلف الغشاء غير محددة كما هو موثق من قبل TATS المجهري ينبغي أن يؤدي مراجعة نقدية وتصحيح الإجراءات العزلة. منذ الجودة العزلة الخلية وغشاء TATS التصور وتقدير ترتبط في جوهرها، وبروتوكولات مناقشتها في هذه المقالة تغطي جميع الجوانب الرئيسية كاستراتيجية مستمرة.
تحديا إضافيا وقضية مشتركة من الدراسات القلب، وتلف الخلايا و / أو فقدان الخلية تحدث بسبب التدخلات المساس عملية الأيض على سبيل المثال، بعد احتشاء عضلة القلب 9، ولكن يجب أن يحكم عليها من اشتعال غير مقصود الضرر على سبيل المثال، بعد انسداد الهواء دون أن يلاحظها أحد خلال العزلة الخلية. عزلة myocytes القلب من قلوب المريضة قد يؤدي إلى إضافية، فقدان الخلية كبيرة وانخفضت عائدات الخلية. ولذلك، comparison من العدد الكلي للخلايا سليمة معزولة بين السيطرة والقلوب المريضة يمكن أن تكون ذات مغزى إذا تم تطبيق العزلة الخلية والعد مستمر من خلال بروتوكولات موحدة. وبالتالي، فمن الأهمية بمكان أن نحكم سلامة الخلية من خلال مجموعة المراقبة المناسبة، مما يعكس أفضل جودة ممكنة العضلية العزلة الخلية. الأهم من ذلك، نوعية الخلايا الفردية والمجهر الخلايا الحية من المريضة بصحة جيدة مقابل مقابل myocytes تضررت عن غير قصد من قبل إجراء العزل قد تؤثر بشكل كبير على تحليل شبكات غشاء TATS. البروتوكولات المعروضة هنا بالتالي التأكيد على سلامة واستقرار مكونات غشاء الفسيولوجية خلال عزل الخلايا والخلايا الحية المجهري الأغشية سليمة. تم تصميم سير العمل بأكمله كاستراتيجية مستمرة لتحقيق والحفاظ على سليمة مكونات غشاء TATS مع استبعاد الخلايا التالفة، لأن هذه سوف يحمل عزلة التحف غشاء تعتمد مثل الأنابيب الغشاء تعطلت، membranالفقاعات الإلكترونية، وشبكات TATS تغيير بطريق الخطأ تحت شروط مراقبة وتحليل مزيد من تنازلات الكمي. بالعكس، نفس استراتيجيات حاسمة للدراسات تدخل مع القدرة على تعطيل الأغشية TATS، التي تعتمد بشكل كبير على الضوابط مقارنة ذات مغزى بين الصواب صحية مقابل الخلايا المريضة حقيقية مع TATS التغييرات الغشاء.
بالإضافة إلى ذلك، نتناول إجراءات لتحقيق العزلة من الناحية الفنية أكثر من ذلك بكثير تحديا الخلايا AM. على الرغم من التقدم والبروتوكولات المحسنة، فمن المهم التأكيد على أنه ليست تافهة لإعادة إنتاج العزلة خلية عالية الجودة من نظام رصد السفن وحتى أقل موثوقية لهيئة علماء المسلمين. ويرجع ذلك إلى انخفاض العائد الكلي للخلايا AM فيها حتى الأخطاء الصغيرة أو تغيرات خلال العزلة الخلية قد يؤدي إلى فشل إتمام AM زنزانة انفرادية هذا، في حين أن درجة خفيفة من تلف الخلايا VM قد يكون أقل وضوحا في تعليق خلية بسبب خلية عالية نسبيا أرقام مقارنة AM. منذ قد تصبح خلايا AM جurved بعد العزلة، ويمكن من خلال تحليل العديد رويس يكون من المفيد كما هو موضح في الخطوة 4.3. بعد إجراء مفصل لخطوات العزلة خلية، ونحن نقدم بروتوكول للالمباشر لا يتجزأ تلطيخ غشاء ومتحد البؤر أو STED superresolution التصوير شبكات TATS على حد سواء لنظام رصد السفن وAMS. هذه البروتوكولات تمكن كل من التحليل الكمي والتفريق بين مكونات مختارة من الأغشية TATS من خلال المعايير المحددة سابقا. بالمقارنة مع نظام رصد السفن، المنظمة 3D والسلوكيات الوظيفية للشبكة TATS الأذيني في AMS هي حاليا أقل مفهومة.
وقد وضعت إجراءات لأغشية صورة TATS في الخلايا الحية (الخطوات 3،1-3،7) مع متحد البؤر التجاري (جدول المواد / المعدات) والعرف STED المجاهر مضان 9. لتحسين إعدادات المجهر لتوليد صورة الفلورسنت والتحليل الكمي TATS، والنقاط التالية هي ذات أهمية عامة:
على النقيض من استراتيجيات تحليل المباشرة المقدمة هنا، والمنشورات السابقة واصفا الأغشية TATS والتغيرات مرض ذات الصلة، واستخدمت قراءات مجموع المباراتين الإقليمية الكثافة T-أنبوب صغير كاستراتيجية الكمية 16،17، أو استراتيجيات إقليمية غير المباشرة على أساس فورييه TRANSFormation تحليل الإشارات غشاء مخططة من أجل تقييم T-أنبوب صغير مكون انتظام 7. في المقابل، فإن النهج الكمية الموصوفة هنا ترتبط مباشرة إلى مكونات TATS الفردية وتوفير عدد من معلمات إضافية بما في ذلك الغشاء خصائص الشبكة وعناصر محددة مثل النسبة المئوية للA-الأنابيب. وعلاوة على ذلك، يمكن قياس كثافة شبكة TATS وطول تسويته للهيكل عظمي كامل في منطقة استخراج العائد على الاستثمار. عدد التقاطعات ثلاثية من ثلاثة الفرد، مكونات أنبوب صغير مرتبطة باستمرار يمكن استخدام كمقياس لمدى تعقيد المتفرعة من شبكة غشاء TATS. نلاحظ أن أي تحليل لأصغر مكونات TATS يعتمد على إجراءات تلطيخ. في تجربتنا، 800 ميكرولتر من 50 ميكرومتر دى 8 ANEPPS حل تكفي لصبغ شبكات TATS كاملة في بيليه الخلية التي تحتوي على 50،000 خلايا VM 9. ومع ذلك، إذا كان بيليه الخلية يحتوي على عدد أقل من myocytes القلب، إذا ما كشف عن مضان قوية المتاحة، وإذا التصوير متحد البؤر توزيع شبكة TATS العام بدلا من أصغر التفاصيل الغشاء والتغيرات الكمية هي المصالح، صبغ تركيزات منخفضة يمكن استخدام على أساس الاختبار التجريبي. أخيرا، ماكرو برامج مكتوبة لتحليل ووصف يمكن استخدامها لأتمتة معالجة الصور خطوات لتسهيل تحليل مجموعات البيانات الكبيرة، وهي مفيدة بشكل خاص للمقارنة بين مختلف المجموعات المعالجة (مثل المخدرات)، أنواع الخلايا (على سبيل المثال، صباحا مقابل VM )، والتدخلات المرضية في جسم المريض (على سبيل المثال، صورية مقابل احتشاء عضلة القلب).
لتحليل الصور من شبكات TATS، يتم تطبيق التسلسل التالي من الخطوات المبدأ: 1) شعرة معاوية خلفية الطرح (4.5.1) لإزالة الاختلافات المكانية في كثافة الخلفية؛ 2) تعزيز التباين المحلي (4.5.2)؛ 3) تجانس الصورة (4.5.3). 4) المنطقة الإحصائية دمج (4.5.4). 5) تحديدعتبة صورة binarization (4.5.6). و6) حساب بيانات الهيكل العظمي (4.5.8). خطوة حاسمة خلال skeletonization من الصور TATS الفلورسنت هي binarization الصورة هو مبين في الشكل 6. الخطوات العتبة المرتبطة تحدد في نهاية المطاف التي يتم الكشف عن الهياكل غشاء الحقيقية لتمثيل المكونات الأساسية TATS مقابل الهياكل يحتمل كاذبة حددها خطأ من الضوضاء في الخلفية. تحديد عتبة الصحيحة لتحليل الصور ثنائي يجب أن تتوافق مع TATS أوفياء الهياكل الغشائية، الذي يعتمد على الإشارة إلى الضوضاء (SNR) نسبة عالية بما فيه الكفاية لكل من النهج المجهري متحد البؤر وsuperresolution. ولذلك، ينبغي إنشاء جودة الصورة كافية الأول، وبعد ذلك مع الجمع بين الحس النقدي من نوعية الخلايا الفردية بما في ذلك الوثائق بصور الحقل مشرقة على النحو المبين. الخيارات البديلة للتكيف بروتوكول الصورة تجزئة لإخراج البيانات المجهر معين و / أو فيزوتشمل الأسئلة iological deconvolution صورة العتبة والإجراءات الأخرى مثل "أوتسو" أو "ايزو البيانات" متاح والإضافات يماغيج. بغض النظر عن الإجراء تجزئة النهائي، ونحن نعتبر المقارنة بين البيانات واستخراج الخام عن طريق تراكب الصور خطوة إلزامية مراقبة الجودة. وباختصار، فإن سلامة المورفولوجية وغشاء myocytes الفردية المعزولة، وتلطيخ كاف من الأغشية TATS داخل الخلايا، وتحسين المعلمة للتصوير مضان، والسيطرة تراكب البيانات المستخرجة الهيكل العظمي تسهم جميعها في نوعية الصور TATS الفلورسنت والنتائج الكمية.
إذا تم استخدام الأنواع أكبر من الماوس لعزل الخلايا، وبروتوكولات يمكن تكييفها بسهولة حسب الاقتضاء. لأكبر الأنواع المقبلة، قلوب الفئران يمكن مقنى حادة مع 14 G قنية (القطر الخارجي 2.1 مم) وperfused لفي 8 مل / دقيقة. كبير قد تتطلب قلوب كبار السن أو المريضة قنية أحجام أكبر. في الجينراؤول، يمكن إجراء التروية القلبية إما عن طريق الضغط المستمر على سبيل المثال، باستخدام 1 م ارتفاع عمود المياه بين الخزان والشريان الأورطي أو عن طريق تدفق مستمر باستخدام مضخة تمعجية. لعزل الخلايا من قلوب القوارض الصغيرة مثل الفئران والجرذان قد يكون من المفيد تدفق مستمر منذ كولاجيناز الهضم سوف تعطل في نهاية المطاف الأوعية التاجية مما يؤدي إلى مقاومة معدلات التروية المفرطة من تسرب سرير السفينة التي سوف تسيطر إلى حد ما عن طريق بروتوكولات التدفق المستمر. في المقابل، نضح الضغط المستمر هو مفيد إذا رصد معدل التدفق الصحيح والقسطرة هي الأولوية، وهو أمر مفيد لنماذج التدخل مع السلوكيات مقاومة الأوعية الدموية غيرت فضلا عن تدريب الإجراءات العزلة الخلية.
على النحو المبين أعلاه، جودة خلية كافية مهمة جدا للدراسات الكمية نظم الأغشية الداخلية. ومع ذلك، خلال نضح القلب والهضم كولاجيناز عوامل عديدة يمكن CRitically تؤثر على نوعية من العزلة الخلية، والتي لا ينبغي أبدا الاستهانة خلال تحسين بروتوكول أو الخلل 27. على وجه الخصوص، ينبغي تحديد النشاط من الكثير كولاجيناز نظرا لأنسجة معينة من الاهتمام مثل الأذينين أو البطينين قبل تنفيذ الدراسات التجريبية الحسنة النية إلى تهيئة الظروف العزلة إلى الحفاظ عليها طوال الفترة المتبقية من الدراسة. وعلاوة على ذلك، فإن نوعية المياه، ودرجة الحموضة، ودرجة الحرارة، والتحسين والتنظيف من الإعداد نضح تقليل خطر الضرر غير مقصود من الملوثات والصمات، وعوامل إضافية محتملة يتعين رصدها لتهيئة الظروف المثلى خلال التماثل الساكن العزلة الخلية. يستخدم BDM (2،3-butanedione-monoxime) مثبط عكوس للميوسين أتباز الجسور عبر شيوعا أثناء تشريح الأنسجة وهضم للحفاظ على استرخاء العضلات القلبية، مما يزيد من العائد من العزلة الخلية. ومع ذلك، يحتاج الباحثون ر س تكون على علم بأن BDM قد تمارس أنشطة الفوسفاتيز غير محددة مما يؤدي إلى آثار خارج الهدف على سبيل المثال، تثبيط نا + / كا التيارات 2+ الصرف في ظل ظروف معينة 33. بالنسبة لبعض التجارب أنه قد يكون من المفيد لاستبدال BDM بواسطة blebbistatin كحل شل القلب، المانع مع قابلية عالية للميوسين بتركيزات مكرومولي الذي هو، ومع ذلك، السامة ومكلفة نسبيا وربما غيرها من الآثار خارج الهدف. يجب أن يستريح العضلية صحية لا تظهر أي تقلصات في غياب التحفيز الكهربائي ومثل هذه الخلايا ينبغي استبعادها من مزيد من التحليل. من ناحية أخرى، تقلص القلب العضلية والاسترخاء ردا على التحفيز الكهربائي في الكالسيوم خارج الخلية الفسيولوجية 2+ تركيزات يمكن استخدامها لإنشاء مقلص السلوك العادي كتدبير إضافي لتقييم نوعية الخلايا الوظيفية و / أو سلوك غير طبيعي في أمراض القلب مقابل السيطرة صحية الخلايا.
<p class="jove_content"> وباختصار، فإن البروتوكولات لعزل خلية واحدة وتحليل الصور الكمي الموصوفة هنا قد طبقت بنجاح للفحص المجهري متحد البؤر وsuperresolution شبكة غشاء TATS في VM 9 وأنا 21 الخلايا فضلا عن التحليل الكمي للشبكات في أنيبيب myocytes القلب ثابتة (لا تظهر البيانات). هذه التطبيقات والمستقبلية من البروتوكولات قد فتح آفاقا لمجموعة متنوعة من الأسئلة التجريبية مثل توصيف الأغشية TATS في مراحل تنموية مختلفة أو تحليل غشاء المرتبطة البروتين أو عضية الهياكل التي الاتصال بشبكة TATS لممارسة محلية للغاية، مجال معين الإشارات وظائف في وAM VM الخلايا.The authors have nothing to disclose.
This work received support through Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB 1002 (subprojects A05 and B05 to S.E.L.) and KFO 155 (subproject 4 to S.E.L.), a Halbach Foundation award to S.E.L. supporting E.W.; a grant from the German Cardiac Society to S.B.; and a DAAD exchange program supporting T.K. as visitor at the University of Maryland. The research leading to these results has received funding from the European Community’s Seventh Framework Program FP7/2007-2013 under grant agreement No. HEALTH-F2-2009-241526, EUTrigTreat (to S.E.L.). S.E.L. is a principal investigator of the German Center of Cardiovascular Research (DZHK).
Chemicals and enzymes | |||
2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich, Munich, Germany | B0753 | |
Bovine calf serum | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | SH30073 | Triple 0.1 µm sterile filtered. |
CaCl2 | Sigma-Aldrich, Munich, Germany | 21115 | Diluted 1:10 in MQ water to obtain 100 mM CaCl2 stock concentration. |
Collagenase type II | Worthington via Cell Systems, Troisdorf, Germany | on request | Enzymatic activity depends on individual collagenase batches. Collagenase II and other enzyme activities (Caseinase, Clostripain, Tryptic) can be assessed in the "collagenase lot selection tool". Determine cell yield and quality individually for each new lot of collagenase. |
Glucose | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | HN06.1 | |
Heparin | Rotexmedica, Trittau, Germany | PZN-03862340 | Diluted in 0,9 % NaCl and injected subcutaneuosly in abdominal skin. |
HEPES | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 9105.4 | |
Forene 100% (V/V) | Abbott, Libertyville, IL, USA | B506 | Active agent: isoflurane, 250 ml. Use approximately 2 Vol% in air/oxygen dispenser instrument. |
KCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 6781.3 | |
KH2PO4 | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3904.2 | |
Laminin (2 mg/ml) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 354232 | Lamination is described under step 2.1. |
MgCl2 · 6 H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 2189.2 | |
MgSO4 · 7 H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8283.2 | |
Na2HPO4 · 2 H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4984.2 | |
NaHCO3 | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | HN01.1 | |
Taurin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4721.2 | |
Dyes | |||
Di-8-ANEPPS | Molecular Probes, Life Technologies, Darmstadt, Germany | D-3167 | Stock solution 2 mM in DMSO |
Trypan blue | Sigma-Aldrich, Munich, Germany | T8154 | Trypan blue is gently mixed 1:1 via tip-cut 1 ml plastic pipette with cell suspension prior to cell counting in Neubauer cytometer. |
Langendorff perfusion setup | |||
Circulation thermostat | Lauda, Lauda-Königshofen, Germany | Please refer to Louch et al. (JMCC 2011). Heat up thermostat und buffers in perfusion tubing to 37 °C 15 min prior to use. | |
Flexible silicone tubing Tygon for peristaltic pump | VWR, Darmstadt, Germany | 224-2252 | Tubing needs to be changed regularly. |
Flexible silicone tubing Tygon for thermostat | VWR, Darmstadt, Germany | 228-4340 | |
Heating coil surroundung perfusion tubing | Rettberg, Göttingen, Germany | custom-made | Heating coil and tubing needs to be cleaned thoroughly via MQ water after using. Do not use detergents. Glass components should be bathed regularly in 10 mM NaOH overnight. |
Peristaltic pump | Ismatec, Wertheim, Germany | ISM830 | |
Three way stop cock Discofix C Luer Lock 10 cm | Braun, Melsungen, Switzerland | 16500C | |
Three way stop cock Discofix 3SC | Braun, Melsungen, Switzerland | 4095146 | |
Instruments | |||
42 mm glass coverslips | Menzel Gläser via Thermo Scientific, Schwerte, Germany | on request | 0.13 – 0.16 mm thickness |
Cannula 21G | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lake, NY, USA | 304432 | Cut to a length of ~ 5 mm, roughened with sandpaper. |
Coverslips for Neubauer cytometer 24 x 24 mm | Menzel Gläser via Thermo Scientific, Schwerte, Germany | on request | 0.38 – 0.42 mm thickness |
Graefe forceps, 0.5 mm tips, slight curve | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11151-10 | |
LSM 710 NLO | Carl Zeiss, Jena, Germany | 63x 1.4 NA oil objective | |
Neubauer improved cytometer | Labor Optik, Friedrichsdorf, Germany | 1100000 | Counting procedure: Wipe cytometer and coverslip provided with the counting chamber with 70 % ethanol. Press coverslip gently on the counting chamber so that the two glass surfaces are in contact and Newton's rings can be observed. Subsequently, 10 – 20 µl cell suspension can be applied to the edge of the coverslip to be sucked into the void by capillary action. Count the intact vs. defect myocytes using the squares of the cytometer grid which reflects 100 nl. Repeat counting procedure on the second grid provided on the cytometer. Calculate the density of cells in your original cell suspension by taking account of any dlutions and counting shortcuts. |
POC-R2 Imaging Chamber | Pecon, Erbach, Germany | Cell suspension volume: 800 µl; desired plating density: ~ 1000 AM and ~ 10,000 VM | |
Spring scissors, 8 mm blades straight, blunt | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 15025-10 | |
Student dumont #7 forceps, inox | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 91197-00 | |
Student iris scissors, curved, 11.5 cm | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 91461-11 | |
Student iris scissors, straight, 11.5 cm | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 91460-11 | |
Student surcigal scissors, straight, sharp, 12 cm | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 91402-12 | |
Tissue forceps, 1×2 teeth, slim, 10 cm | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11023-10 |