Understanding the neural substrates of behavior requires brain circuit ensemble recording. Because of its genetic tractability, the mouse offers a model for circuit dissection and disease mimicry. Here, a method of designing and fabricating miniaturized probes is described that is suitable for targeting deep brain structure in the mouse.
Il numero di indagini fisiologiche del muscolo topo, mus, ha sperimentato un recente aumento, parallelamente alla crescita nei metodi di genetica di targeting per microcircuito dissezione e la modellazione della malattia. L'introduzione di optogenetics, per esempio, ha permesso per la manipolazione bidirezionale di neuroni geneticamente identificati, ad una risoluzione temporale senza precedenti. Per capitalizzare su questi strumenti e ottenere informazioni sui interazioni dinamiche tra microcircuiti cerebrali, è essenziale che si ha la possibilità di registrare da insiemi di neuroni in profondità all'interno del cervello di questo piccolo roditore, in entrambe le preparazioni testa-fisso e liberamente comportarsi. Per registrare da strutture profonde e strati di cellule distinti richiede una preparazione che permette l'avanzamento preciso degli elettrodi verso regioni cerebrali desiderati. Per registrare insiemi neurali, è necessario che ciascun elettrodo sia indipendente mobile, permettendo lo sperimentatore per risolvere singole celle lasciando neighbelettrodi oring indisturbati. Per fare entrambe le cose in un mouse liberamente comportarsi richiede un'unità elettrodo che è leggero, resistente e altamente personalizzabile per il targeting strutture cerebrali specifiche.
Una tecnica per la progettazione e la fabbricazione in miniatura, peso ultraleggero, schiere di elettrodi Microdrive che sono singolarmente personalizzabili e facilmente assemblati da parti disponibili in commercio è presentato. Questi dispositivi sono facilmente scalabili e possono essere personalizzati per la struttura nel mirino; è stato utilizzato con successo per registrare dalle regioni talamiche e corticali in un animale liberamente comportarsi durante comportamento naturale.
Mus musculus ha, grazie alla sua trattabilità genetica, diventato rapidamente il modello animale di scelta per i fisiologi interessati a livello microcircuito dissezione di neuroni geneticamente identificati e nelle indagini modelli murini di malattie umane. Ad esempio, la recente introduzione di strumenti genetici causali, quali attuatori optogenetic genetiche e chimiche ha permesso sperimentali per testare la necessità e la sufficienza dei circuiti neurali individuati nel comportamento 1-4. L'ampia disponibilità di linee ricombinanti transgeniche driver del mouse (Cre-linee), ha amplificato la facilità sperimentale con cui sottotipi neuronali sono mirati, aggiungendo al valore del mouse per questi esperimenti 5.
Allo stesso modo, gli schermi genetiche e genomiche ampie associazioni di disturbi neurologici e psichiatrici comuni hanno facilitato l'identificazione dei fattori di rischio genetici per la malattia del cervello 6,7. Questi progressi, in combinazione con la crescitastrumenti per la manipolazione genetica e l'ingegneria del genoma nei topi, hanno reso l'organismo di scelta per la modellazione di malattie umane. La combinazione di modelli di malattia e strumenti genetiche causali offre un'opportunità senza precedenti per capire la malattia del cervello e individuare gli obiettivi a livello di circuito per gli interventi.
Per sfruttare al meglio questi strumenti molecolari e ottenere informazioni in funzione microcircuito in salute e malattia, è essenziale per loro coppia con letture fisiologiche di attività cerebrale. Idealmente, lo sperimentatore sarebbe in grado di controllare un gran numero di neuroni mantenendo la risoluzione di singola cellula. Extracellulari, registrazioni multi-elettrodo in animali si comportano liberamente fornire tale opportunità; Tuttavia, l'uso di questa tecnologia nel topo è stato limitato. Per registrare da piccoli bersagli (ad esempio, strato CA1 nell'ippocampo), è necessario in quanto piccoli movimenti di elettrodi di registrazione seguenti Surgic l'uso di elettrodi regolabilial impianto rendono impossibile per mantenere la stabilità di registrazione 8,9. Tradizionalmente, i metodi che sono stati impiegati per spostare gli elettrodi nel cervello impongono limitazioni di peso quando usato nel topo, rendendo difficile accoppiare la registrazione di un gran numero di neuroni con comportamento in questo organismo.
Qui, vengono introdotti i metodi per la fabbricazione in miniatura, ultra-leggeri, matrici di microelettrodi che sono singolarmente personalizzabili per la regione del cervello in fase di mira, optogenetics-compatibile e facilmente assemblati da parti disponibili in commercio. Ogni "microdrive" all'interno del multi-elettrodo "hyperdrive" utilizza un meccanismo a molla-e-vite per far avanzare l'elettrodo e una guida di plastica, integrato nel corpo hyperdrive, per contrastare la coppia dalla vite. In primo luogo, il processo di progettazione dei corpi dell'iperguida e microdrive in un programma CAD per la stampa 3D è descritta. Progettando corpi dell'iperguida che sono personalizzatiper strutture specifiche, è possibile aumentare la precisione di targeting e di aumentare ulteriormente il rendimento del preparato. In secondo luogo, il processo di fabbricazione è descritto in dettaglio, in cui l'array multi-elettrodo viene assemblato a mano da parti che sono disponibili in commercio. Questa tecnica è stata utilizzata, con successo, di registrare da insiemi di neuroni nell'ippocampo, nel talamo e la corteccia l'animale libero di comportarsi durante foraggiamento naturale e le attività operanti.
Questo protocollo descrive il processo di costruzione di una matrice microdrive ultra-leggero per il targeting un unico o più regioni del cervello nel topo. Dopo le fasi finali di costruzione, il hyperdrive è pronto per essere impiantato utilizzando tecniche di impianto chirurgico standard e apposto cranio del mouse con cemento dentale. Messaggio impianto, gli elettrodi possono ogni essere avanzato in maniera indipendente con un piccolo cacciavite, mentre il mouse è trattenuto a mano. La distanza per turno che ogni elettrodo anticipi è determinata dal passo della vite. Utilizzando le viti di riferimento qui avanza ogni elettrodo circa 150 mm per ogni turno, se la metà e quarti di giro possono essere utilizzati per una maggiore risoluzione.
Le dimensioni del disegno in Figura 1B determinano la dimensione complessiva dell'impianto, dunque, un modo ovvio per ridimensionare impianti bidirezionalmente è cambiare le dimensioni su quel disegno critico. Inoltre, the lunghezza delle viti può essere esteso per indirizzare le strutture cerebrali profonde. Si consiglia su ordine viti in titanio, come quelli sono leggeri e meno fragile rispetto all'acciaio. Si noti che le rotaie antitorque bisogno di scalare linearmente con la lunghezza della vite, ed a questo punto non hanno determinato la lunghezza massima a cui queste strutture possono essere stampati. Per indirizzare più regioni cerebrali, la forma del pezzo inferiore può essere modificato. L'aggiunta di rondelle di dimensioni conosciute (spessore 200 micron), potrebbe fornire distanziatori necessari tra poliimmidi destinate strutture cerebrali distinte (per esempio, ippocampo e corteccia prefrontale). Questi potrebbero essere inclusi nella procedura pezzo di montaggio inferiore, e poi tagliare dopo la resina epossidica indurisce.
Un grande limite di questo progetto è la sua dipendenza da software proprietario (Solidworks in questo caso). Il futuro sviluppo di programmi open source che forniscono interfacce user friendly favorevole alla progettazione di tali apparecchiature con il minimo ingegneria backggiro sarebbe di enorme beneficio per la comunità neuroscienze.
Questo metodo fornisce diversi vantaggi rispetto ai metodi esistenti. In primo luogo, il design è semplice, dipende molto pochi schizzi (Figura 1). In secondo luogo, è ultra-leggero, che non richiede cemento dentale o materiale pesante per andare nel suo assemblaggio. Nel complesso, pesa circa 1,7 g – quasi un terzo del peso della protesi in commercio di una funzionalità simile. In terzo luogo, non richiede attrezzature specializzate per rendere – il corpo dell'impianto può essere stampato in 3D da diverse fonti (ad esempio approto.com, ma ci sono molti altri); le viti possono essere realizzati su misura (per esempio antrinonline.com); le molle sono disponibili in commercio (ad esempio leesprings.com); e di conseguenza l'intero processo di assemblaggio può avvenire in un giorno. Infine, questi impianti sono stati utilizzati per registrare da diverse regioni del cervello durante il foraggiamento naturale, compiti comportamentali strutturati e sonno (Figura5).
Le future applicazioni di questo metodo includono attuare la sua scalabilità. E 'probabile che l'impianto può essere bidirezionale scalata semplicemente cambiando 1) le dimensioni del disegno in figura 1B e, 2) il numero di recipienti microdrive (Figura 1D) fantasia. Ad esempio, si può essere scalato verso il basso per registrare da topi si comportano liberamente nelle prime fasi di sviluppo, e scalato verso l'alto per registrare da ratti, conigli, furetti e primati non umani, forse.
Una parola finale è quello di ricordare al lettore che critica per attuare con successo il metodo di cui è al prototipo eventuali modifiche che implementano stl file di progettazione allegati. Il lettore noterà, per esempio, che il disegno allegato contiene una "figura 8" rotaia antitorque. Questo è stato il miglior progetto data la limitazione di stampa 3D, come spesso viene richiesto che perforiamo questi fori. Avere esso un cerchio, avrebbe compstabilità romise, ma avendo esso un quadrato o una forma angolata limiterebbe la capacità di fissare le imperfezioni di stampa 3D da perforazione.
The authors have nothing to disclose.
We thank members of the Wilson lab for their helpful advice on the fabrication method.
This work was supported by the Simons Foundation, a NIH pathway to independence career award from the NINDS and a NARSAD Young Investigator Award (to M.M.H.) as well as grants from the NIH (to M.A.W.).
Part Name | Manufacturer | Catalogue # (if applicable) | Part Description |
Microdrive screws | Antrin | Half Circle .6UNM Titanium Screws. 8mm thread. 9mm length from under head. | |
Tap-ease | AGS CO. | #TA2 | Tapping Grease |
Microdrives | See .STL file | ||
Drive Body | See .STL file | ||
Outer Polyimide Guide Tube | Minvasive Components | IWG Item # 72113300022-012 | Length:12’’, |
ID:.0071’’, | |||
OD:.0116’’, | |||
WALL:.00225’’ | |||
Inner Polyimide Guide Tube | Minvasive Components | IWG Item # 72113900001-012 | Length: 12’’, |
ID:.0035’’, | |||
OD:.0055’’, | |||
WALL:.001’’ | |||
Grounding Wire | A-M Systems, Inc. | Catalog # 791900 | .008'' Bare, .011'' Coated |
Tri-Flow | Teflon based lubricant – Aerosol | ||
Microdrive Springs | Lee Spring | Part # CB0050B 07 E | Outside Diameter: 1.016 mm |
Hole Diameter: 1.193 mm | |||
Wire Diameter: 0.127 mm | |||
Free Length 10.160 mm | |||
Solid Length 3.581 mm | |||
Z-poxy 5 Minute | Pacer Technology (Zap) | PT37 | |
Silver Paint | GC Electronics | Part #: 22-023 | Silver Print II |
Tri-Flow | 20009 | ||
26 Gauge Hypodermic Tube – Stainless Steel | Small Parts | HTXX-26T-12-10 | Length: 12’’ |
ID: .012’’ | |||
OD: .018’’ | |||
EIB screws | Component Supply Co. | MX-0090-03SP | #00-90 x 3/16’’ |
Fine Scissors – Toughcut | Fine Science Tools | 14058-09 | 22mm |
Transparency Paper | 3M | PP2500 | |
Aluminum Foil | Reynold's Wrap Heavy Duty | Extra Thick |