Ontwerp en de fabricage van Ultralight Gewicht, verstelbare Multi-elektrode Probes voor elektrofysiologische registraties in Muizen
Summary
Understanding the neural substrates of behavior requires brain circuit ensemble recording. Because of its genetic tractability, the mouse offers a model for circuit dissection and disease mimicry. Here, a method of designing and fabricating miniaturized probes is described that is suitable for targeting deep brain structure in the mouse.
Abstract
Het aantal fysiologische onderzoeken in de muis, Mus musculus, heeft ervaren een recente stijging, parallel met de groei van de methoden van genetische targeting voor microschakelings- dissectie en ziektemodel. De invoering van optogenetics bijvoorbeeld is toegestaan voor bidirectionele manipulatie van genetisch geïdentificeerde neuronen, met ongekende tijdsresolutie. Om te profiteren van deze instrumenten en inzicht in dynamische interacties tussen hersenen microschakelingen, is het noodzakelijk dat men de mogelijkheid opnemen ensembles van neuronen diep in de hersenen van deze kleine knaagdieren, zowel hoofd-vaste en vrij gedragen preparaten. Op te nemen van diepe structuren en verschillende cellagen vereist een voorbereiding die precieze opbouw van de elektroden naar de gewenste gebieden van de hersenen mogelijk maakt. Neurale ensembles nemen, is het noodzakelijk dat elke elektrode afzonderlijk beweegbaar, zodat de experimentator om individuele cellen te lossen terwijl neighboring elektroden ongestoord. Om beide te doen in een vrij te gedragen muis vereist een elektrode schijf die is licht van gewicht, veerkrachtig en zeer aanpasbare voor gericht op specifieke hersenstructuren.
Een techniek voor het ontwerpen en fabriceren van miniatuur, ultralichte gewicht, microdrive elektrode arrays die zijn individueel aanpasbaar en eenvoudig te monteren van in de handel verkrijgbare onderdelen wordt gepresenteerd. Deze apparaten zijn eenvoudig schaalbaar en kan worden aangepast aan de structuur van het doelwit; Het is met succes gebruikt voor het opnemen van de thalamus en corticale gebieden in een vrij te gedragen dier tijdens het natuurlijke gedrag.
Introduction
Mus musculus heeft door de genetische traceerbaarheid snel het diermodel van de keuze voor fysiologen geïnteresseerd in microschakeling niveau dissectie van genetisch geïdentificeerde neuronen en het onderzoeken muismodellen van menselijke ziekte. Zo is de recente introductie van causale genetische hulpmiddelen, zoals optogenetische en chemische genetische actuatoren toegestaan experimentalisten naar de noodzaak en de toereikendheid van de geïdentificeerde neurale circuits te testen in het gedrag van 1-4. De ruime beschikbaarheid van recombinant transgene muizen driver lijnen (Cre-lijnen) is geamplificeerd de experimentele gemak waarmee neuron subtypes zijn gericht, waardoor de waarde van muis voor deze experimenten 5.
Ook hebben genetische screens en genoomwijde verenigingen van voorkomende neurologische en psychiatrische aandoeningen de identificatie van genetische risicofactoren voor hersenziekte 6,7 vergemakkelijkt. Deze voordelen, gecombineerd met de groeiendetoolbox voor genetische manipulatie en genoom techniek bij muizen, hebben het het organisme van de keuze voor het modelleren van ziekte bij de mens gemaakt. De combinatie van de ziekte-modellen en causale genetische gereedschap biedt een ongekende kans voor het begrijpen van de hersenen ziekte en het identificeren van circuit-level targets voor interventies.
Om optimaal te profiteren van deze moleculaire hulpmiddelen en inzicht te krijgen in microschakelings- functie in gezondheid en ziekte, is het essentieel om paar ze met fysiologische uitlezen van hersenactiviteit. Idealiter zou de experimentator kunnen controleren een groot aantal neuronen terwijl de enkele cel resolutie. Extracellulaire, multi-elektrode opnames in vrij gedragen dieren bieden dergelijke gelegenheid; echter, heeft het gebruik van deze technologie in de muis beperkt. Op te nemen van kleine doelen (bijvoorbeeld, CA1 laag in de hippocampus), het gebruik van verstelbare elektroden is nodig omdat kleine bewegingen in de opname elektroden volgende surgical implantatie maken het onmogelijk om de opname stabiliteit 8,9 te handhaven. Traditioneel, de methoden die zijn gebruikt om naar elektroden in de hersenen leggen gewichtsbeperkingen bij gebruik in de muis, waardoor het moeilijk te koppelen registratie van een groot aantal neuronen met gedrag in dit organisme.
Hier worden methoden geïntroduceerd voor het vervaardigen van miniatuur, ultra-lichtgewicht, micro-elektrode arrays die individueel aanpasbaar aan de hersenen regio wordt gericht, optogenetics-compatibel zijn, en eenvoudig te monteren van in de handel verkrijgbare onderdelen. Elke "microdrive" binnen de multi-elektrode "hyperdrive" maakt gebruik van een veer-en-schroef mechanisme om de elektrode en een plastic rail vooruit, ingebouwd in de hyperdrive lichaam, om het koppel tegen te gaan van de schroef. Eerst wordt het proces van het ontwerpen van de hyperdrive organen en microdrives in een CAD-programma voor 3D printen beschreven. Door het ontwerpen van hyperdrive lichamen die zijn aangepastspecifieke structuren, is het mogelijk de nauwkeurigheid van targeting vergroten en verdere verhoging van het rendement van de bereiding. Ten tweede wordt het fabricageproces beschreven, waarbij de meervoudige elektrode-reeks is met de hand uit delen die commercieel verkrijgbaar zijn. Deze techniek is gebruikt, met succes, op te nemen van ensembles van neuronen in de hippocampus, thalamus en cortex in de vrij gedragen dier tijdens natuurlijke foerageergebied en operante taken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft het proces van het construeren van een ultralichte microdrive matrix voor het richten van een enkele of meerdere hersengebieden in de muis. Na de laatste stappen van de bouw, de hyperdrive is klaar om te worden geïmplanteerd met behulp van standaard chirurgische implantatie technieken en aangebracht op de muis schedel met tandcement. Na implantatie, de elektroden kunnen elk worden gevorderd zelfstandig met een kleine schroevendraaier, terwijl de muis wordt met de hand tegengehouden. De afstand per beurt dat elke elektrode vooruitgang wordt bepaald door de spoed van de schroef. De schroeven hier verwezen vooruitgang elke elektrode ongeveer 150 mm per beurt, hoewel halve en kwart-bochten kan worden gebruikt voor grotere resolutie.
De afmetingen van de schets in figuur 1B bepalen de totale omvang van het implantaat dus een duidelijke manier om implantaten bidirectioneel schaal is om de afmetingen van die kritische schets veranderen. Bovendien, the lengte van de schroeven kunnen worden uitgebreid tot diepere hersenstructuren richten. We raden aan op maat gemaakte titanium schroeven, als die zijn licht en minder broos dan staal. Merk op dat de antitorque rails moeten lineair schalen met de schroeflengte, en op dit punt hebben we niet bepaald de maximale lengte waarmee deze structuren kunnen worden afgedrukt. Om meerdere gebieden van de hersenen te richten, kan de vorm van het onderste stuk worden gewijzigd. De toevoeging van bekende sized ringen (dikte 200 urn), kan spacers nodig tussen polyimiden gericht op afzonderlijke hersenstructuren (bijvoorbeeld hippocampus en prefrontale cortex) verschaffen. Deze kunnen worden opgenomen in het bodemdeel montagestappen en later afgesneden nadat de epoxy verhardt.
Een grote beperking van dit ontwerp is de afhankelijkheid van proprietary software (Solidworks in dit geval). Toekomstige ontwikkeling van open source programma's die gebruiksvriendelijke interfaces bieden bevorderlijk voor het ontwerpen van dergelijke apparatuur met minimale technische achtergronronde van enorm voordeel voor de neurowetenschappen zou zijn.
Deze werkwijze verschaft verscheidene voordelen over bestaande werkwijzen. Ten eerste het ontwerp is eenvoudig afhankelijk weinig tekeningen (figuur 1). Ten tweede, het is ultra-licht, waarvoor geen tandheelkundige cement of zwaar materiaal in de assemblage te gaan. Kortom, weegt ongeveer 1,7 g – bijna een derde van het gewicht van commercieel verkrijgbare implantaten van dezelfde functionaliteit. Ten derde, het vereist geen speciale apparatuur om te maken – het implantaat lichaam kan worden 3D geprint uit meerdere bronnen (bijvoorbeeld approto.com, maar er zijn een aantal anderen); De schroeven kunnen op maat gemaakt (bijvoorbeeld antrinonline.com); de veren zijn commercieel verkrijgbaar (bijvoorbeeld leesprings.com); en daardoor de gehele assemblage proces kan gebeuren in een dag. Ten slotte hebben deze implantaten zijn gebruikt voor het opnemen van meerdere gebieden van de hersenen tijdens de natuurlijke foerageergebied, gestructureerde gedragstaken en slaapproblemen (Figuur5).
Toekomstige toepassingen van deze methode zijn onder meer de uitvoering van haar schaalbaarheid. Het is waarschijnlijk dat het implantaat bidirectioneel eenvoudig kan worden aangepast door het veranderen van 1) de grootte van de schets in figuur 1B en 2) het aantal microdrive houders (figuur 1D) gevormd. Bijvoorbeeld, kan het naar beneden worden geschaald naar record uit vrijelijk gedragen muizen vroeg in de ontwikkeling, en geschaald naar boven te nemen van ratten, konijnen, fretten en misschien niet-menselijke primaten.
Een laatste woord is aan de lezer die essentieel zijn voor een succesvolle uitvoering van de geschetste methode is om eventuele wijzigingen zij uitvoeren naar ontwerp toegevoegde bestanden .stl prototype herinneren. De lezer zal opmerken, bijvoorbeeld, dat de bijgevoegde ontwerp bevat een "figuur 8" antitorque rail. Dit was de beste ontwerpen mogelijk gezien de beperking van 3D printen, zoals het vaak vereist dat we boor deze gaten. Het hebben van het zijn van een cirkel, zou compromise stabiliteit, maar dat het een plein of een schuine vorm zou de mogelijkheid om 3D-printing onvolkomenheden op te lossen door het boren te beperken.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank members of the Wilson lab for their helpful advice on the fabrication method.
This work was supported by the Simons Foundation, a NIH pathway to independence career award from the NINDS and a NARSAD Young Investigator Award (to M.M.H.) as well as grants from the NIH (to M.A.W.).
Materials
| Part Name | Manufacturer | Catalogue # (if applicable) | Part Description |
| Microdrive screws | Antrin | Half Circle .6UNM Titanium Screws. 8mm thread. 9mm length from under head. | |
| Tap-ease | AGS CO. | #TA2 | Tapping Grease |
| Microdrives | See .STL file | ||
| Drive Body | See .STL file | ||
| Outer Polyimide Guide Tube | Minvasive Components | IWG Item # 72113300022-012 | Length:12’’, |
| ID:.0071’’, | |||
| OD:.0116’’, | |||
| WALL:.00225’’ | |||
| Inner Polyimide Guide Tube | Minvasive Components | IWG Item # 72113900001-012 | Length: 12’’, |
| ID:.0035’’, | |||
| OD:.0055’’, | |||
| WALL:.001’’ | |||
| Grounding Wire | A-M Systems, Inc. | Catalog # 791900 | .008'' Bare, .011'' Coated |
| Tri-Flow | Teflon based lubricant – Aerosol | ||
| Microdrive Springs | Lee Spring | Part # CB0050B 07 E | Outside Diameter: 1.016 mm |
| Hole Diameter: 1.193 mm | |||
| Wire Diameter: 0.127 mm | |||
| Free Length 10.160 mm | |||
| Solid Length 3.581 mm | |||
| Z-poxy 5 Minute | Pacer Technology (Zap) | PT37 | |
| Silver Paint | GC Electronics | Part #: 22-023 | Silver Print II |
| Tri-Flow | 20009 | ||
| 26 Gauge Hypodermic Tube – Stainless Steel | Small Parts | HTXX-26T-12-10 | Length: 12’’ |
| ID: .012’’ | |||
| OD: .018’’ | |||
| EIB screws | Component Supply Co. | MX-0090-03SP | #00-90 x 3/16’’ |
| Fine Scissors – Toughcut | Fine Science Tools | 14058-09 | 22mm |
| Transparency Paper | 3M | PP2500 | |
| Aluminum Foil | Reynold's Wrap Heavy Duty | Extra Thick |
Riferimenti
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
- Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu Rev Neurosci. 34, 389-412 (2011).
- Alexander, G. M., et al. Remote control of neuronal activity in transgenic mice expressing evolved G protein-coupled receptors. Neuron. 63, 27-39 (2009).
- Halassa, M. M., et al. Selective optical drive of thalamic reticular nucleus generates thalamic bursts and cortical spindles. Nat Neurosci. 14, 1118-1120 (2011).
- Tsien, J. Z., et al. Subregion- and cell type-restricted gene knockout in mouse brain. Cell. 87, 1317-1326 (1996).
- Nestler, E. J., Hyman, S. E. Animal models of neuropsychiatric disorders. Nat Neurosci. 13, 1161-1169 (2010).
- Collins, P. Y., et al. Grand challenges in global mental health. Nature. 475, 27-30 (2011).
- Wilson, M. A., McNaughton, B. L. Dynamics of the hippocampal ensemble code for space. Science. 261, 1055-1058 (1993).
- Wilson, M. A., McNaughton, B. L. Reactivation of hippocampal ensemble memories during sleep. Science. 265, 676-679 (1994).
- Nguyen, D. P., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly. J Vis Exp. (26), (2009).
