Summary

فحص فينوطيبيك مجهري للقياس الكمي للبكتيريا الفطرية داخل الخلايا المكيفة للفحص عالي الإنتاجية/عالي المحتوى

Published: January 17, 2014
doi:

Summary

هنا، ونحن نصف الفحص phenotypic ينطبق على شاشات عالية الإنتاجية / عالية المحتوى من الحمض النووي الريبي الاصطناعية التدخل الصغيرة (siRNA)، مركب كيميائي، والمكتبات متحولة السل الميكوباكتيريوم. تعتمد هذه الطريقة على الكشف عن السل الفطري المسمى بالفلورسنت داخل الخلية المضيفة المسماة بالفلورسنت باستخدام المجهر الكونفوكوكال الآلي.

Abstract

على الرغم من توافر العلاج واللقاح، لا يزال السل واحدا من أكثر الأمراض البكتيرية فتكا وانتشارا في العالم. منذ عدة عقود، يشكل الانفجار المفاجئ للسلالات المقاومة للأدوية المتعددة والواسعة النطاق تهديدا خطيرا لمكافحة السل. لذلك، من الضروري تحديد أهداف ومسارات جديدة حاسمة للعامل المسبب لمرض السل، والسل الميكوباكتريا (Mtb) والبحث عن مواد كيميائية جديدة يمكن أن تصبح أدوية السل. ويتمثل أحد النهج في وضع أساليب مناسبة للشاشات الجينية والكيميائية للمكتبات الكبيرة الحجم التي تمكن من البحث عن إبرة في كومة قش. وتحقيقا لهذه الغاية، قمنا بتطوير فحص فينوتوبيكال يعتمد على الكشف عن Mtb المسمى فلوريا داخل الخلايا المضيفة المسماة بالفلورسنت باستخدام المجهر الكونفوجال الآلي. يسمح هذا الفحص المختبري بتقدير كمي قائم على الصورة لعملية استعمار Mtb في المضيف وتم تحسينه لتنسيق 384 microplate جيدا ، وهو مناسب لشاشات مكتبات المتحولة ذات المركبات الكيميائية أو Mtb. ثم تتم معالجة الصور للتحليل متعدد البارامترات ، والذي يوفر قراءة الاستدلال على الإمراض من Mtb داخل الخلايا المضيفة.

Introduction

من بين مسببات الأمراض المعدية الناشئة والناشئة التي تم الإبلاغ عنها خلال السنوات الماضية ، يحتل مرض السل الفطري(Mtb)مكانا بارزا كونه مسؤولا عن 1.4 مليون حالة وفاة و 8.7 مليون إصابة جديدة في عام 2011 (تقرير السل العالمي 2012 ، www.who.int/topics/tuberculosis/en/). على الرغم من توافر العلاجات متعددة الأدوية ، فإن عدد المصابين لا يزال في ارتفاع ومقاومة الأدوية المتعددة (MDR) وكذلك مقاومة للأدوية على نطاق واسع (XDR) Mtb تنتشر بسرعة في جميع أنحاء العالم1. وعلاوة على ذلك، عند الأخذ في الاعتبار وجود مستضدات Mtb، فمن الواضح أن ثلث سكان العالم يعتبرون مصابين بشكل كامن من قبل Mtb. إحصائيا، في حالة واحدة من أصل عشرة، هناك تطور نحو الشكل النشط للمرض مع الأعراض السريرية اللاحقة2. لذلك، هناك حاجة ماسة إلى وسائل جديدة لمحاربة Mtb. في هذا السياق، قمنا بتطوير اختبار في المختبر الظاهري الظاهري تعتمد على رصد غزو Mtb والضرب في الخلايا المضيفة عن طريق المجهر الفلوري confocal الآلي3. التكيف من المقايسة في لوحات microtiter 384 جيدا في تركيبة مع اقتناء الصور الآلي وتحليلها ، وسمح عالية المحتوى / عالية الإنتاجية فحص (HC / HTS) من المكتبات متوسطة النطاق من المركبات ، siRNAs والمسوخ البكتيرية. وهكذا مكن فحص مكتبة RNAi واسعة الجينوم على هذا الفحص الظاهري من تحديد العوامل المضيفة الرئيسية المشاركة في الاتجار Mtb والنسخ المتماثل داخل الخلايا ولكن أيضا توضيح مسارات المضيف التي تستغلها عصيات الدرنة. وكان التكيف آخر من هذا الفحص phenotypic خاصة لتحديد العوامل البكتيرية الأساسية لاستمرار Mtb داخل البلعوم. على سبيل المثال ، يعتبر اعتقال النضج البلعوم واحدة من الآليات الرئيسية التي تسهل بقاء وتكرار Mtb في الضامة. رصد توطين subcellular من المسوخ Mtb خروج المغلوب في مقصورات الفلورسنت المسمى الحمضية يسمح لتحديد الجينات البكتيرية المشاركة في عملية البقاء على قيد الحياة4. وأخيرا ، فإن التصوير عالي المحتوى من Mtb يقدم أيضا طريقة ممتازة لقياس كفاءة الدواء لتثبيط الظواهر المختلفة مثل النمو البكتيري داخل الخلايا3. بالإجمال، هذا النوع من الفحص الظاهري عالي الإنتاجية يسمح بتسريع اكتشاف الأدوية ضد السل والبيانات التي تجمعها هذه النهج المختلفة تساهم في فهم أفضل للتلاعب المضيف الذي تمارسه Mtb.

Protocol

1. عالية الإنتاجية الجينوم على نطاق فحص سيرنا الفحص الذي تم إجراؤه في نموذج خلايا الالتهاب الرئوي من النوع الثاني البشري A549 عند العدوى مع Mtb H37Rv مع التعبير عن بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP). ويرد هذا الإجراء في الشكل 1A. Resuspend مكتبة siRNA المجففة التي يتم تخزينها في لوح…

Representative Results

فحص سيرنا عالي الإنتاجية على نطاق الجينوم Mtb قادرة على استعمار الخلايا المناعية في المختبر، فضلا عن العديد من الخلايا الظهارية الرئة الأخرى. على سبيل المثال، Mtbقادرة على إصابة وتلف الخلايا الظهارية A549 التي تستخدم عادة كنموذج للخلايا الرئوية من النوع الثاني ال?…

Discussion

نحن نصف هنا الطرق المطلوبة لإجراء فحص فينوتبيك باستخدام سلالة MTB H37Rv المعبرة عن GFP لإصابة الخلايا المضيفة المسماة بالفلورسنت ، مما يجعلها مناسبة للشاشات عالية المحتوى / عالية الإنتاجية. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول على مجموعة واسعة من المركبات، والتحقيقات الفلورية والمسوخ Mtb. لكل ?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد قدمت الجماعة الأوروبية الدعم المالي لهذا العمل (ERC-STG INTRACELLTB Grant n° 260901، وMM4TB Grant n° 260872)، والوكالة الوطنية للإعادة إلى الخلايا، والفيدر (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed)، والمنطقة نورد باس دي كاليه. ونحن نعترف بامتنان بالمساعدة التقنية التي يقدمها غاسبار ديلويسون، وإليزابيث فيركمايستر، وأنطونينو بونجيوفاني، وفرانك لافون من منصة BICeL.

Materials

µclear-plate black, 384 well Greiner bio-one 781091 127.8/86/15 MM with Lid, TC treated
CellCarrier 384 well plate PerkinElmer 6007550 Black, Clear Bottom, with Lid, TC treated
V-bottom white , 384 well-plate Greiner bio-one 781280
sealing tape, breathable, sterile Corning 3345
Lipofectamine RNAiMax Life Technologies 13778150 Transfection reagent
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich 34943
RPMI 1640 + GlutaMAX-I Life Technologies 61870-010 Cell culture medium
D-PBS 1X [-]MgCl2/[-]CaCl2 Life Technologies 14190-094 Dulbecco's Phosphate Salin Buffer
D-PBS 1X [+]MgCl2/[+]CaCl2 Life Technologies 14190-091 Dulbecco's Phosphate Salin Buffer
Fetal bovine serum Life Technologies 2610040-79
FICOLL PAQUE PLUS DUTSCHER 17-1440-03 Ficoll for Peripherical Blood Monocyte Cells purification
CD14 MicroBeads, human Miltenyi 130-050-201 Purification of CD14+ Monocytes
Human M-CSF, premium gr. (1000 μg) Miltenyi 130-096-493 Macrophage Colony Stimulating Factor
LS Columns Miltenyi 130-042-401 Columns for CD14+ Monocytes isolation
Tween 80 Euromedex 2002-A Mycobacteria culture
Glycerol high purity Euromedex 50405-EX Mycobacteria culture
Middlebrook OADC enrichment Becton-Dickinson 211886 Mycobacteria culture
7H9 Becton-Dickinson W1701P Mycobacteria culture
Versene 1X Life Technologies 15040033 Non enzymatic cell dissociation solution
DAPI Life Technologies D1306 Nuclei dye
Hoechst 33342 Life Technologies H3570 Nuclei dye
Syto60 Life Technologies S11342 Nuclei/cytoplasm dye
Formalin Sigma-Aldrich HT5014 Cell fixation solution
siRNA targeting Dectin-1 Santa-Cruz sc-63276
*siGenome* Non targeted siRNA pool Dharmacon D-001206-14
Rifampicin Sigma-Aldrich R3501 antibiotic
Isoniazid (INH) Sigma-Aldrich I3377-50G antibiotic
Hygromycin B Life Technologies 10687-010 antibiotic
Amikacin Sigma-Aldrich A1774 antibiotic
Automated Confocal Microscope OPERA PerkinElmer Image acquisition
Columbus 2.3.1 Server Database PerkinElmer Data transfert, storage and analysis
Acapella 2.6 software PerkinElmer Image-based analysis
GraphPad Prism5 software GraphPad Statistical analysis
Excel 2010 Microsoft Statistical analysis

Riferimenti

  1. Gandhi, N. R., et al. Multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis: a threat to global control of tuberculosis. Lancet. 375, 1830-1843 (2010).
  2. Barry, C. E., et al. The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and intervention strategies. Nat. Rev. Microbiol. 7, 845-855 (2009).
  3. Christophe, T., Ewann, F., Jeon, H. K., Cechetto, J., Brodin, P. High-content imaging of Mycobacterium tuberculosis-infected macrophages: an in vitro model for tuberculosis drug discovery. Future Med. Chem. 2, 1283-1293 (2010).
  4. Brodin, P., et al. High content phenotypic cell-based visual screen identifies Mycobacterium tuberculosis acyltrehalose-containing glycolipids involved in phagosome remodeling. PLoS Pathog. 6, (2010).
  5. Bermudez, L. E., Goodman, J. Mycobacterium tuberculosis invades and replicates within type II alveolar cells. Infect. Immun. 64, 1400-1406 (1996).
  6. Dobos, K. M., Spotts, E. A., Quinn, F. D., King, C. H. Necrosis of lung epithelial cells during infection with Mycobacterium tuberculosis is preceded by cell permeation. Infect. Immun. 68, 6300-6310 (2000).
  7. McDonough, K. A., Kress, Y. Cytotoxicity for lung epithelial cells is a virulence-associated phenotype of Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun. 63, 4802-4811 (1995).
  8. Lee, H. M., Yuk, J. M., Shin, D. M., Jo, E. K. Dectin-1 is inducible and plays an essential role for mycobacteria-induced innate immune responses in airway epithelial cells. J. Clin. Immunol. 29, 795-805 (2009).
  9. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
  10. Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat. Methods. 6, 569-575 (2009).
  11. Carralot, J. P., et al. Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure. J. Biomol. Screen. 14, 151-160 (2009).
  12. Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J. Biomol. Screen. 16, 775-785 (2011).
  13. Song, O. R., et al. Confocal-based method for quantification of diffusion kinetics in microwell plates and its application for identifying a rapid mixing method for high-content/throughput screening. J. Biomol. Screen. 15, 138-147 (2010).

Play Video

Citazione di questo articolo
Queval, C. J., Song, O., Delorme, V., Iantomasi, R., Veyron-Churlet, R., Deboosère, N., Landry, V., Baulard, A., Brodin, P. A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening. J. Vis. Exp. (83), e51114, doi:10.3791/51114 (2014).

View Video