فحص فينوطيبيك مجهري للقياس الكمي للبكتيريا الفطرية داخل الخلايا المكيفة للفحص عالي الإنتاجية/عالي المحتوى
Summary
هنا، ونحن نصف الفحص phenotypic ينطبق على شاشات عالية الإنتاجية / عالية المحتوى من الحمض النووي الريبي الاصطناعية التدخل الصغيرة (siRNA)، مركب كيميائي، والمكتبات متحولة السل الميكوباكتيريوم. تعتمد هذه الطريقة على الكشف عن السل الفطري المسمى بالفلورسنت داخل الخلية المضيفة المسماة بالفلورسنت باستخدام المجهر الكونفوكوكال الآلي.
Abstract
على الرغم من توافر العلاج واللقاح، لا يزال السل واحدا من أكثر الأمراض البكتيرية فتكا وانتشارا في العالم. منذ عدة عقود، يشكل الانفجار المفاجئ للسلالات المقاومة للأدوية المتعددة والواسعة النطاق تهديدا خطيرا لمكافحة السل. لذلك، من الضروري تحديد أهداف ومسارات جديدة حاسمة للعامل المسبب لمرض السل، والسل الميكوباكتريا (Mtb) والبحث عن مواد كيميائية جديدة يمكن أن تصبح أدوية السل. ويتمثل أحد النهج في وضع أساليب مناسبة للشاشات الجينية والكيميائية للمكتبات الكبيرة الحجم التي تمكن من البحث عن إبرة في كومة قش. وتحقيقا لهذه الغاية، قمنا بتطوير فحص فينوتوبيكال يعتمد على الكشف عن Mtb المسمى فلوريا داخل الخلايا المضيفة المسماة بالفلورسنت باستخدام المجهر الكونفوجال الآلي. يسمح هذا الفحص المختبري بتقدير كمي قائم على الصورة لعملية استعمار Mtb في المضيف وتم تحسينه لتنسيق 384 microplate جيدا ، وهو مناسب لشاشات مكتبات المتحولة ذات المركبات الكيميائية أو Mtb. ثم تتم معالجة الصور للتحليل متعدد البارامترات ، والذي يوفر قراءة الاستدلال على الإمراض من Mtb داخل الخلايا المضيفة.
Introduction
من بين مسببات الأمراض المعدية الناشئة والناشئة التي تم الإبلاغ عنها خلال السنوات الماضية ، يحتل مرض السل الفطري(Mtb)مكانا بارزا كونه مسؤولا عن 1.4 مليون حالة وفاة و 8.7 مليون إصابة جديدة في عام 2011 (تقرير السل العالمي 2012 ، www.who.int/topics/tuberculosis/en/). على الرغم من توافر العلاجات متعددة الأدوية ، فإن عدد المصابين لا يزال في ارتفاع ومقاومة الأدوية المتعددة (MDR) وكذلك مقاومة للأدوية على نطاق واسع (XDR) Mtb تنتشر بسرعة في جميع أنحاء العالم1. وعلاوة على ذلك، عند الأخذ في الاعتبار وجود مستضدات Mtb، فمن الواضح أن ثلث سكان العالم يعتبرون مصابين بشكل كامن من قبل Mtb. إحصائيا، في حالة واحدة من أصل عشرة، هناك تطور نحو الشكل النشط للمرض مع الأعراض السريرية اللاحقة2. لذلك، هناك حاجة ماسة إلى وسائل جديدة لمحاربة Mtb. في هذا السياق، قمنا بتطوير اختبار في المختبر الظاهري الظاهري تعتمد على رصد غزو Mtb والضرب في الخلايا المضيفة عن طريق المجهر الفلوري confocal الآلي3. التكيف من المقايسة في لوحات microtiter 384 جيدا في تركيبة مع اقتناء الصور الآلي وتحليلها ، وسمح عالية المحتوى / عالية الإنتاجية فحص (HC / HTS) من المكتبات متوسطة النطاق من المركبات ، siRNAs والمسوخ البكتيرية. وهكذا مكن فحص مكتبة RNAi واسعة الجينوم على هذا الفحص الظاهري من تحديد العوامل المضيفة الرئيسية المشاركة في الاتجار Mtb والنسخ المتماثل داخل الخلايا ولكن أيضا توضيح مسارات المضيف التي تستغلها عصيات الدرنة. وكان التكيف آخر من هذا الفحص phenotypic خاصة لتحديد العوامل البكتيرية الأساسية لاستمرار Mtb داخل البلعوم. على سبيل المثال ، يعتبر اعتقال النضج البلعوم واحدة من الآليات الرئيسية التي تسهل بقاء وتكرار Mtb في الضامة. رصد توطين subcellular من المسوخ Mtb خروج المغلوب في مقصورات الفلورسنت المسمى الحمضية يسمح لتحديد الجينات البكتيرية المشاركة في عملية البقاء على قيد الحياة4. وأخيرا ، فإن التصوير عالي المحتوى من Mtb يقدم أيضا طريقة ممتازة لقياس كفاءة الدواء لتثبيط الظواهر المختلفة مثل النمو البكتيري داخل الخلايا3. بالإجمال، هذا النوع من الفحص الظاهري عالي الإنتاجية يسمح بتسريع اكتشاف الأدوية ضد السل والبيانات التي تجمعها هذه النهج المختلفة تساهم في فهم أفضل للتلاعب المضيف الذي تمارسه Mtb.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن نصف هنا الطرق المطلوبة لإجراء فحص فينوتبيك باستخدام سلالة MTB H37Rv المعبرة عن GFP لإصابة الخلايا المضيفة المسماة بالفلورسنت ، مما يجعلها مناسبة للشاشات عالية المحتوى / عالية الإنتاجية. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول على مجموعة واسعة من المركبات، والتحقيقات الفلورية والمسوخ Mtb. لكل ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد قدمت الجماعة الأوروبية الدعم المالي لهذا العمل (ERC-STG INTRACELLTB Grant n° 260901، وMM4TB Grant n° 260872)، والوكالة الوطنية للإعادة إلى الخلايا، والفيدر (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed)، والمنطقة نورد باس دي كاليه. ونحن نعترف بامتنان بالمساعدة التقنية التي يقدمها غاسبار ديلويسون، وإليزابيث فيركمايستر، وأنطونينو بونجيوفاني، وفرانك لافون من منصة BICeL.
Materials
| µclear-plate black, 384 well | Greiner bio-one | 781091 | 127.8/86/15 MM with Lid, TC treated |
| CellCarrier 384 well plate | PerkinElmer | 6007550 | Black, Clear Bottom, with Lid, TC treated |
| V-bottom white , 384 well-plate | Greiner bio-one | 781280 | |
| sealing tape, breathable, sterile | Corning | 3345 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | Transfection reagent |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 34943 | |
| RPMI 1640 + GlutaMAX-I | Life Technologies | 61870-010 | Cell culture medium |
| D-PBS 1X [-]MgCl2/[-]CaCl2 | Life Technologies | 14190-094 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| D-PBS 1X [+]MgCl2/[+]CaCl2 | Life Technologies | 14190-091 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 2610040-79 | |
| FICOLL PAQUE PLUS | DUTSCHER | 17-1440-03 | Ficoll for Peripherical Blood Monocyte Cells purification |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi | 130-050-201 | Purification of CD14+ Monocytes |
| Human M-CSF, premium gr. (1000 μg) | Miltenyi | 130-096-493 | Macrophage Colony Stimulating Factor |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | Columns for CD14+ Monocytes isolation |
| Tween 80 | Euromedex | 2002-A | Mycobacteria culture |
| Glycerol high purity | Euromedex | 50405-EX | Mycobacteria culture |
| Middlebrook OADC enrichment | Becton-Dickinson | 211886 | Mycobacteria culture |
| 7H9 | Becton-Dickinson | W1701P | Mycobacteria culture |
| Versene 1X | Life Technologies | 15040033 | Non enzymatic cell dissociation solution |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | Nuclei dye |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Nuclei dye |
| Syto60 | Life Technologies | S11342 | Nuclei/cytoplasm dye |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT5014 | Cell fixation solution |
| siRNA targeting Dectin-1 | Santa-Cruz | sc-63276 | |
| *siGenome* Non targeted siRNA pool | Dharmacon | D-001206-14 | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | antibiotic |
| Isoniazid (INH) | Sigma-Aldrich | I3377-50G | antibiotic |
| Hygromycin B | Life Technologies | 10687-010 | antibiotic |
| Amikacin | Sigma-Aldrich | A1774 | antibiotic |
| Automated Confocal Microscope OPERA | PerkinElmer | Image acquisition | |
| Columbus 2.3.1 Server Database | PerkinElmer | Data transfert, storage and analysis | |
| Acapella 2.6 software | PerkinElmer | Image-based analysis | |
| GraphPad Prism5 software | GraphPad | Statistical analysis | |
| Excel 2010 | Microsoft | Statistical analysis |
Riferimenti
- Gandhi, N. R., et al. Multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis: a threat to global control of tuberculosis. Lancet. 375, 1830-1843 (2010).
- Barry, C. E., et al. The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and intervention strategies. Nat. Rev. Microbiol. 7, 845-855 (2009).
- Christophe, T., Ewann, F., Jeon, H. K., Cechetto, J., Brodin, P. High-content imaging of Mycobacterium tuberculosis-infected macrophages: an in vitro model for tuberculosis drug discovery. Future Med. Chem. 2, 1283-1293 (2010).
- Brodin, P., et al. High content phenotypic cell-based visual screen identifies Mycobacterium tuberculosis acyltrehalose-containing glycolipids involved in phagosome remodeling. PLoS Pathog. 6, (2010).
- Bermudez, L. E., Goodman, J. Mycobacterium tuberculosis invades and replicates within type II alveolar cells. Infect. Immun. 64, 1400-1406 (1996).
- Dobos, K. M., Spotts, E. A., Quinn, F. D., King, C. H. Necrosis of lung epithelial cells during infection with Mycobacterium tuberculosis is preceded by cell permeation. Infect. Immun. 68, 6300-6310 (2000).
- McDonough, K. A., Kress, Y. Cytotoxicity for lung epithelial cells is a virulence-associated phenotype of Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun. 63, 4802-4811 (1995).
- Lee, H. M., Yuk, J. M., Shin, D. M., Jo, E. K. Dectin-1 is inducible and plays an essential role for mycobacteria-induced innate immune responses in airway epithelial cells. J. Clin. Immunol. 29, 795-805 (2009).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat. Methods. 6, 569-575 (2009).
- Carralot, J. P., et al. Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure. J. Biomol. Screen. 14, 151-160 (2009).
- Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J. Biomol. Screen. 16, 775-785 (2011).
- Song, O. R., et al. Confocal-based method for quantification of diffusion kinetics in microwell plates and its application for identifying a rapid mixing method for high-content/throughput screening. J. Biomol. Screen. 15, 138-147 (2010).
