Un Ensayo Fenotípico Microscópico Para La Cuantificación De Micobacterias Intracelulares Adaptadas Para La Detección De Alto Rendimiento / Alto Contenido
Summary
Aquí, se describe un ensayo fenotípico aplicable a las pantallas de alto rendimiento / alto contenido de ARN sintético de interferencia pequeña (siRNA), compuesto químico, y bibliotecas de mutantes de Mycobacterium tuberculosis. Este método se basa en la detección de tuberculosis de la micobacteria fluorescentemente etiquetada dentro de la célula huésped etiquetada fluorescentemente usando microscopia confocal automatizada.
Abstract
A pesar de la disponibilidad de terapia y vacuna, la tuberculosis (TB) sigue siendo una de las infecciones bacterianas más mortales y extendidas del mundo. Desde hace varias décadas, la explosión repentina de cepas multirresistentes y ampliamente resistentes a los medicamentos es una grave amenaza para el control de la tuberculosis. Por lo tanto, es esencial identificar nuevas dianas y vías críticas para el agente causal de la tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb)y buscar nuevos productos químicos que podrían convertirse en fármacos contra la tuberculosis. Un enfoque es establecer métodos adecuados para las pantallas genéticas y químicas de bibliotecas a gran escala que permitan la búsqueda de una aguja en un pajar. Con este fin, desarrollamos un ensayo fenotípico que se basa en la detección de Mtb marcado fluorescentemente dentro de las células huésped etiquetadas fluorescentemente utilizando microscopía confocal automatizada. Este ensayo in vitro permite una cuantificación basada en imágenes del proceso de colonización de Mtb en el huésped y se optimizó para el formato de microplaca de 384 pozos, que es adecuado para pantallas de bibliotecas de mutantes de siRNA, compuestos químicos o Mtb. Las imágenes se procesan entonces para el análisis multiparamétrico, que proporciona la lectura hacia fuera que infiere en la patogenesia del Mtb dentro de las células huesped.
Introduction
Entre los patógenos infecciosos emergentes y reemergentes reportados durante los últimos años, Mycobacterium tuberculosis (Mtb)ocupa un lugar destacado siendo responsable de 1,4 millones de muertes y 8,7 millones de nuevas infecciones en 2011 (Informe Mundial de Tuberculosis 2012, www.who.int/topics/tuberculosis/en/). A pesar de la disponibilidad de terapias multidrogas, el número de personas infectadas sigue en aumento y el Mtb multirresistente (MDR) y ampliamente farmacorresistente (XDR) se está extendiendo rápidamente por todo el mundo1. Por otra parte, si se tiene en cuenta la presencia de antígenos mtb, es evidente que un tercio de la población mundial se considera que está infectada latentemente por mtb. Estadísticamente, en un caso de cada diez, hay evolución hacia la forma activa de la enfermedad con síntomas clínicos posteriores2. Por lo tanto, se necesitan con urgencia nuevos medios para luchar contra el Mtb. En este contexto, desarrollamos un ensayo fenotípico visual in vitro basado en el seguimiento de la invasión de Mtb y la multiplicación en las células huésped mediante microscopía de fluorescencia confocal automatizada3. La adaptación del ensayo en placas de microtíter de 384 pozos en combinación con la adquisición y el análisis automatizados de imágenes, permitió la detección de alto contenido / alto rendimiento (HC / HTS) de bibliotecas de escala media de compuestos, siRNAs y mutantes bacterianos. La investigación de una biblioteca amplia del genoma RNAi en este análisis fenotípico permitió así la identificación de los anfitrión-factores dominantes implicados en tráfico de Mtb y la réplica intracelular pero también la aclaración de los anfitrión-caminos explotados por el bacilo del tubérculo. Otra adaptación de este análisis fenotípico particular estaba para la identificación de los factores bacterianos esenciales a la persistencia intraphagosomal del Mtb. Por ejemplo, la detención de la maduración del fagosoma se considera como uno de los principales mecanismos que facilita la supervivencia y replicación de Mtb en los macrófagos. El monitoreo de la localización subcelular de mutantes knock-out mtb en compartimentos fluorescentemente etiquetados como ácidos permitió la identificación de genes bacterianos involucrados en el proceso de supervivencia4. Finalmente, la imagen de alto contenido de Mtb también ofrece un excelente método para cuantificar la eficiencia de los fármacos para inhibir diversos fenómenos como el crecimiento bacteriano intracelular3. En conjunto, este tipo de ensayo fenotípico de alto rendimiento permite acelerar el descubrimiento de fármacos contra la TB y los datos recogidos por estos diferentes enfoques contribuyen a una mejor comprensión de la manipulación del huésped ejercida por Mtb.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se describen aquí los métodos necesarios para un ensayo fenotípico utilizando una cepa de Mtb H37Rv que expresa GFP para infectar las células huésped etiquetadas fluorescentemente, lo que lo hace apropiado para pantallas de alto contenido / alto rendimiento. Este protocolo podría aplicarse a una amplia gama de compuestos, sondas fluorescentes y mutantes mtb. Para cada protocolo descrito anteriormente, se podrían realizar pasos de fijación e inmunoetiquetado antes de la adquisición de imágenes….
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El apoyo financiero para este trabajo fue proporcionado por la Comunidad Europea (ERC-STG INTRACELLTB Grant n° 260901, MM4TB Grant n° 260872), la Agence Nationale de Recherche, el Feder (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed) y la Region Nord Pas de Calais. Agradecemos la asistencia técnica de Gaspard Deloison, Elizabeth Werkmeister, Antonino Bongiovanni y Frank Lafont de la plataforma BICeL.
Materials
| µclear-plate black, 384 well | Greiner bio-one | 781091 | 127.8/86/15 MM with Lid, TC treated |
| CellCarrier 384 well plate | PerkinElmer | 6007550 | Black, Clear Bottom, with Lid, TC treated |
| V-bottom white , 384 well-plate | Greiner bio-one | 781280 | |
| sealing tape, breathable, sterile | Corning | 3345 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | Transfection reagent |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 34943 | |
| RPMI 1640 + GlutaMAX-I | Life Technologies | 61870-010 | Cell culture medium |
| D-PBS 1X [-]MgCl2/[-]CaCl2 | Life Technologies | 14190-094 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| D-PBS 1X [+]MgCl2/[+]CaCl2 | Life Technologies | 14190-091 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 2610040-79 | |
| FICOLL PAQUE PLUS | DUTSCHER | 17-1440-03 | Ficoll for Peripherical Blood Monocyte Cells purification |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi | 130-050-201 | Purification of CD14+ Monocytes |
| Human M-CSF, premium gr. (1000 μg) | Miltenyi | 130-096-493 | Macrophage Colony Stimulating Factor |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | Columns for CD14+ Monocytes isolation |
| Tween 80 | Euromedex | 2002-A | Mycobacteria culture |
| Glycerol high purity | Euromedex | 50405-EX | Mycobacteria culture |
| Middlebrook OADC enrichment | Becton-Dickinson | 211886 | Mycobacteria culture |
| 7H9 | Becton-Dickinson | W1701P | Mycobacteria culture |
| Versene 1X | Life Technologies | 15040033 | Non enzymatic cell dissociation solution |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | Nuclei dye |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Nuclei dye |
| Syto60 | Life Technologies | S11342 | Nuclei/cytoplasm dye |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT5014 | Cell fixation solution |
| siRNA targeting Dectin-1 | Santa-Cruz | sc-63276 | |
| *siGenome* Non targeted siRNA pool | Dharmacon | D-001206-14 | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | antibiotic |
| Isoniazid (INH) | Sigma-Aldrich | I3377-50G | antibiotic |
| Hygromycin B | Life Technologies | 10687-010 | antibiotic |
| Amikacin | Sigma-Aldrich | A1774 | antibiotic |
| Automated Confocal Microscope OPERA | PerkinElmer | Image acquisition | |
| Columbus 2.3.1 Server Database | PerkinElmer | Data transfert, storage and analysis | |
| Acapella 2.6 software | PerkinElmer | Image-based analysis | |
| GraphPad Prism5 software | GraphPad | Statistical analysis | |
| Excel 2010 | Microsoft | Statistical analysis |
Riferimenti
- Gandhi, N. R., et al. Multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis: a threat to global control of tuberculosis. Lancet. 375, 1830-1843 (2010).
- Barry, C. E., et al. The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and intervention strategies. Nat. Rev. Microbiol. 7, 845-855 (2009).
- Christophe, T., Ewann, F., Jeon, H. K., Cechetto, J., Brodin, P. High-content imaging of Mycobacterium tuberculosis-infected macrophages: an in vitro model for tuberculosis drug discovery. Future Med. Chem. 2, 1283-1293 (2010).
- Brodin, P., et al. High content phenotypic cell-based visual screen identifies Mycobacterium tuberculosis acyltrehalose-containing glycolipids involved in phagosome remodeling. PLoS Pathog. 6, (2010).
- Bermudez, L. E., Goodman, J. Mycobacterium tuberculosis invades and replicates within type II alveolar cells. Infect. Immun. 64, 1400-1406 (1996).
- Dobos, K. M., Spotts, E. A., Quinn, F. D., King, C. H. Necrosis of lung epithelial cells during infection with Mycobacterium tuberculosis is preceded by cell permeation. Infect. Immun. 68, 6300-6310 (2000).
- McDonough, K. A., Kress, Y. Cytotoxicity for lung epithelial cells is a virulence-associated phenotype of Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun. 63, 4802-4811 (1995).
- Lee, H. M., Yuk, J. M., Shin, D. M., Jo, E. K. Dectin-1 is inducible and plays an essential role for mycobacteria-induced innate immune responses in airway epithelial cells. J. Clin. Immunol. 29, 795-805 (2009).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat. Methods. 6, 569-575 (2009).
- Carralot, J. P., et al. Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure. J. Biomol. Screen. 14, 151-160 (2009).
- Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J. Biomol. Screen. 16, 775-785 (2011).
- Song, O. R., et al. Confocal-based method for quantification of diffusion kinetics in microwell plates and its application for identifying a rapid mixing method for high-content/throughput screening. J. Biomol. Screen. 15, 138-147 (2010).
