Un protocollo strutturato è presentato per un saggio basato su cellule come un test funzionale per predire la prognosi di scoliosi idiopatica utilizzando la spettroscopia dielettrica cellulare (CDS). L'analisi può essere eseguita con cellule fresche o congelate mononucleate del sangue periferico (PBMC) e la procedura è completata entro 4 giorni.
Dettagli Questo protocollo sperimentale e la procedura analitica per un saggio basato su cellule sviluppato nel nostro laboratorio come test funzionale per predire la prognosi di scoliosi idiopatica nei bambini asintomatici e affetti. Il test consiste nella valutazione dello stato funzionale di Gi e Gs proteine nelle cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) mediante spettroscopia dielettrica cellulare (CDS), utilizzando uno strumento basato CDS automatizzato, e la classificazione dei bambini in tre gruppi funzionali (FG1 , FG2, FG3) rispetto al profilo di squilibrio tra il grado di risposta a Gi e Gs stimolazione proteine. La classificazione è ulteriormente confermata dalla effetto differenziale di osteopontina (OPN) sulla risposta alla stimolazione Gi tra i gruppi e la grave progressione della malattia è referenziato da FG2. Approssimativamente, un volume di 10 ml di sangue è necessario per estrarre PBMC dal gradiente Ficoll-e le cellule vengono quindi memorizzati in azoto liquido. Il numero adeguato di PBMC per eseguire il test si ottiene dopo due giorni di coltura cellulare. In sostanza, le cellule vengono incubate con phytohemmaglutinin (PHA). Dopo 24 h di incubazione, il mezzo viene sostituito con un mezzo di coltura privo di PHA per altre 24 ore prima della semina delle cellule e trattamento OPN. Le cellule sono poi spettroscopica a screening per le loro risposte a somatostatina e isoproterenolo, che attivano rispettivamente le proteine Gi e Gs attraverso i loro recettori affini. Sia la somatostatina e isoproterenolo vengono contemporaneamente iniettati con un sistema integrato di fluidica e le risposte delle cellule vengono monitorati per 15 min. Il test può essere eseguita con PBMC freschi o surgelati e la procedura è completata entro 4 giorni.
Scoliosi idiopatica è una deformità della colonna vertebrale di causa sconosciuta generalmente definita come una curvatura laterale superiore a 10 gradi, accompagnati da una rotazione vertebrale 1. La condizione colpisce il 4% della popolazione pediatrica ed è più comunemente diagnosticata tra i 9 ei 13 anni tra 2,3,4. La diagnosi è principalmente di esclusione e viene effettuato solo dopo escludere altre cause di deformità della colonna vertebrale come la malformazione vertebrale, neuromuscolare o disturbi sindromici. Tradizionalmente, l'asimmetria trunkal è rivelato da Adams prova di piegarsi in avanti e misurato con Scoliometer durante l'esame fisico 5. La diagnosi può essere confermata dalla osservazione radiografica della curva e la misurazione dell'angolo utilizzando il metodo di Cobb 6.
Una volta diagnosticata, la principale preoccupazione per i medici nella gestione dei bambini scoliotici è se la curva progredirà. Infatti, la progressione della curva è spesso imprevedibile eè più frequentemente osservata tra le ragazze che nei ragazzi 7. Se non trattata, la curva può progredire notevolmente, creando notevole deformità fisica e anche problemi cardiopolmonari. Queste manifestazioni diventano pericolo di vita quando la curva supera i 70 ° 8,9. Le attuali opzioni di trattamento per prevenire o fermare la progressione della curva sono rinforzi e chirurgia. In generale, rinforzo è raccomandato per le curve tra i 25-40 °, mentre la chirurgia è riservata per le curve superiori a 45 ° o che non rispondono a rinforzo.
Approssimativamente, il 10% dei bambini con diagnosi di scoliosi idiopatica hanno progressione della curva richiedono un intervento chirurgico correttivo 10. Attualmente, non esiste un metodo provato o prova disponibili per identificare questa categoria di pazienti. Di conseguenza, tutti i bambini diagnosticati sono sottoposti a più radiografie per diversi anni, di solito fino a raggiungere la maturità scheletrica. Si stima che i pazienti tipici con scoliosi avrannocirca 22 esami radiologici a una durata di 3 anni 11. A causa del potenziale rischio di molteplici esami radiografici, gli approcci alternativi che potrebbe consentire di eseguire la prognosi della scoliosi idiopatica senza esporre i bambini alle radiazioni ionizzanti sono fortemente auspicabile. Con l'intento di soddisfare tale esigenza, abbiamo precedentemente sviluppato un saggio di screening basato a cella come test prognostico per identificare presto i bambini asintomatici a rischio di sviluppare scoliosi idiopatica. Il test prevede l'esito clinico in bambini asintomatici e affetti da esaminare lo stato funzionale delle proteine Gi e classificare i bambini in tre gruppi funzionali (FG1, FG2 e FG3) secondo il grado di massima risposta alle proteine Gi stimolazione 12 come misurato da CDS sistema basato. Questo sistema è ampiamente utilizzato per valutare la trasduzione del segnale tramite proteine G in vari tipi cellulari 13,14,15,16. Si produce informazioni riguardanti larisposta totale integrata delle cellule agli stimoli esterni misurando variazioni di impedenza in seguito all'attivazione dei recettori della superficie cellulare. Le cellule vengono seminate in micropiastre che contengono elettrodi al fondo dei pozzetti e il sistema applica una piccola tensione che inducono correnti extracellulari e transcellulare. Dopo iniezione composto nel pozzo, recettori della superficie cellulare sono stimolati e si verificano eventi di trasduzione del segnale, portando a cambiamenti cellulari che influenzano il flusso delle correnti extracellulari e transcellulare, e influenzano così la grandezza misurata. Con questo approccio, i pazienti scoliotici ei bambini più a rischio di sviluppare scoliosi sono meno sensibili alla stimolazione della proteina Gi se confrontato con soggetti sani di controllo, e la classificazione si basa sulla percentuale di grado di riduzione rispetto al gruppo di controllo. Le gamme di classificazione sono fissate tra il 10 e il 40% per FG3, 40 e 60% per FG2, e 60 e 90% per FG1 12.
<p class = "jove_content"> Più di recente, abbiamo modificato questo approccio, dimostrando che i tre gruppi funzionali possono essere chiaramente distinti in base al profilo di squilibrio tra la risposta alla stimolazione Gi e Gs. Infatti, abbiamo scoperto che la risposta alla stimolazione Gi predominava in FG3, mentre nessun squilibrio apparente è stata osservata in FG2. Al contrario, FG1 esposto predominanza per la risposta alla stimolazione Gs. Inoltre, abbiamo fornito la prova che i pazienti appartenenti a FG2 sono più a rischio di progressione fino al punto di aver bisogno di un intervento chirurgico 17. La precisione di questo test classificazione è stata ulteriormente migliorata, dimostrando un effetto differenziale di osteopontina (OPN) sulla risposta a stimolazione Gi tra gruppi funzionali.Qui documentiamo la procedura dettagliata di procedure sperimentali e di analisi di questo test funzionale, come attualmente svolto nel nostro laboratorio.
Abbiamo descritto una procedura dettagliata di un test a base di cellule prognostico per la scoliosi idiopatica che è applicabile alle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) di fresco isolato o conservati congelati per un massimo di un anno in azoto liquido. Dato che l'utilizzo PBMC appena isolate è ingombrante quando si verifica gran numero di individui, il procedimento è stato presentato con PBMC congelati che offrono un'alternativa più pratica in ambito clinico. Tuttavia, i problemi con aggregazione delle cellule dopo lo scongelamento sono stati riscontrati quando PBMC congelati sono stati inizialmente utilizzati, portando talvolta alla variabilità inter-analisi. Per massimizzare la riproducibilità, si consiglia di evitare il ciclo gelo-disgelo e con il campione congelato una sola volta. La procedura è molto semplice, consente il rilevamento accurato di difettoso funzione della proteina Gi in breve tempo. Utilizzando questa procedura, bambini asintomatici e scoliotiche possono essere facilmente classificati per prevedere meglio il loro esito clinico, senza alcun pericolo per la loro salute. HoWever, quando si esegue la classificazione secondo il grado di massima risposta alla stimolazione Gi rispetto ai soggetti sani di controllo 12, diversi requisiti per i soggetti di controllo dovrebbe essere raggiunto. Infatti, al fine di avere un confronto corretto coorte, i soggetti di controllo devono essere di età e per sesso, non essere su qualsiasi tipo di farmaco, e di fornire informazioni private, come la storia passata individuale / familiare medica. Tali requisiti possono costituire un ostacolo importante per l'assunzione di soggetti di controllo. Pertanto, eseguendo classificazione esaminando il grado di squilibrio tra la risposta a Gi e Gs proteina stimolazione nello stesso individuo è ideale per eliminare la necessità di usare soggetti di controllo.
L'utilizzo del sistema basato CDS effettuare questo test prognostico è significativo in termini di fornire contemporaneamente Gi-e risposte cellulari Gs-mediate nello stesso dosaggio. Sebbene molti pazienti possono essere classificati senza amambiguità utilizzando la gamma dinamica fissa per questo saggio, un piccolo numero di pazienti esporrà valori al confine di intervalli, come dimostrano i risultati della presente relazione. Per discriminare questi individui, abbiamo introdotto la valutazione dell'effetto di OPN sulla risposta alla stimolazione Gi dimostrando che OPN induce un effetto differenziale sulla risposta cellulare Gi-mediata tra i tre gruppi funzionali. Infatti, abbiamo trovato che in presenza di OPN, risposta alla stimolazione Gi aumenti FG1, mentre diminuisce in FG2 e FG3, in misura superiore a FG2. Nonostante l'elevato costo di OPN, l'uso di questa chemochina è essenziale distinguere casi ambigui, e quindi migliorare la precisione della nostra analisi classificazione. Tuttavia, questo test ha uno svantaggio che un minimo di 1,5 x 10 5 cellule per pozzetto è tenuta a rispettare risposta cellulare con il sistema basato su CDS nelle nostre condizioni sperimentali. Alcuni campioni di pazienti non avranno un numero sufficiente dicellule da testare. In questo caso, è necessario ricordare i pazienti per la raccolta del sangue aggiuntivo, che può essere preoccupante per le famiglie e frustrante per il personale medico e di laboratorio. Studi prospettici sono previsti nel nostro laboratorio per risolvere questo problema.
Tuttavia, l'attuale protocollo si basa su metodi semplici e collaudati per preparare le cellule, mentre il test è automatizzato mediante un sistema privo di etichetta convalidati 13, 14 per monitorare le risposte delle cellule. La piattaforma di prova è relativamente poco costoso se confrontato con piattaforma genetica disponibile per la prognosi di altre malattie. Inoltre, il costo di tutti i materiali monouso, compresi i tubi di raccolta del sangue, punte, l'elettrodo speciale micropiastre, e conica e tubi Eppendorf, non è molto costoso ed è stimato a meno di $ 3.000 a completare un test per circa mille pazienti. Sebbene questa stima non include i costi di manodopera per la preparazione dei campionie di eseguire il test, questo test rimane molto più conveniente rispetto alle piattaforme di sequenziamento di nuova generazione. Degno di nota, non è solo il confronto dei costi di piattaforme genetiche, ma più specificamente legate al campo della AIS, è i costi associati alle immagini radiologiche. Oggi, più di un milione di bambini negli Stati Uniti e circa 100.000 bambini in Canada con diagnosi di scoliosi idiopatica, e il costo totale della diagnosi e monitoraggio dei bambini scoliotici in caso di esposizione ai raggi X è di oltre 2,5 miliardi di dollari ogni anno in Nord America. Quindi, la nostra procedura di analisi cell-based ci si aspetterebbe di essere adatto per lo screening e il monitoraggio dei bambini con scoliosi idiopatica senza rischi per la salute e ad un costo più basso di routine.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da La Fondation Yves Cotrel de l'Institut de France, Parigi, Francia (al Dr. Moreau), la Canadian Institutes of Health Research (Grant PP2-99.466 a Dr. Moreau) e da Fourth Dimension Spine LLC , New York, USA (assegno di ricerca al Dr. Moreau).
Materials | |||
RPMI | Wisent, Inc | 350-005-CL | |
FBS | Therno Scientific Hyclone | SH3007103 | |
DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17144003 | |
Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
Phytohemagglutinin | Invitrogen (Gibco) | 10576-015 | |
Recombinant Human Osteopontin | R&D Systems, Inc | 1433-OP/CF | |
Somatostatin | Tocris | 1157 | |
Isoproterenol | Tocris | 1743 | |
PBS | Wisent, Inc | 311-010-CL | |
Sterile pipette tips | Axygen Scientific | 301-06-451 | |
Sterile Eppendorf tubes | Ultident | 24-MCT-150-C | |
50 ml conical tubes | VWR International | 89039-658 | |
Cellkey small sample 96W microplate | Molecular Devices | 1026496 | |
Cellkey tips | Cybio | OL3800-25-559N | |
Precut pierceable seals | Excel Scientific, Inc | XP-100 | |
Equipment | |||
Vicell XR | Beckman Coulter | 731050 | Automated cell counter |
Cell culture hood | Forma Scientific | 1284 | Class II |
Liquid nitrogen storage | Thermo Scientific | CY5093570 | |
Water bath | VWR International | 89032-204 | |
Standard light microscope | Leica Microsystems | DMIL LED | |
Cell culture incubator | Thermo Scientific | 51019557 | 5% CO2 at 37 °C |
Low speed centrifuge | Thermo Scientific | 75004364 | |
Cellkey system | Molecular Devices | 1019185 | CDS-based instrument |