Eine strukturierte Protokoll für ein Assay auf Zellbasis als Funktionstest zur Vorhersage der idiopathischen Skoliose vorher mit Mobil dielektrischen Spektroskopie (CDS) dargestellt. Der Assay kann mit frischem oder gefrorenem peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) durchgeführt werden und das Verfahren wird in 4 Tagen abgeschlossen.
Dieses Protokoll beschreibt die experimentelle und analytische Verfahren für einen Assay auf Zellbasis in unserem Labor als Funktionstest zur Vorhersage der idiopathischen Skoliose bei asymptomatischen betroffenen Kinder und vorauszusagen. Der Test besteht aus der Bewertung der Funktionszustand und Gi Gs-Proteine in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs), die durch Mobil dielektrischen Spektroskopie (CD), unter Verwendung eines automatisierten CDS-basierten Instrument und die Klassifizierung von Kindern in drei Funktionsgruppen (FG1 , FG2, FG3) in Bezug auf das Profil des Ungleichgewichts zwischen dem Grad der Reaktion auf und Gi Gs-Proteine Stimulation. Die Klassifizierung wird durch die unterschiedliche Wirkung von Osteopontin (OPN) auf Reaktion auf Stimulation Gi zwischen Gruppen und die starke Progression der Krankheit wird durch FG2 verwiesen bestätigt. Ungefähr wird ein Volumen von 10 ml Blut benötigt, um PBMCs durch Ficoll-Gradienten und Zellen extrahiert werden dann in flüssigem Stickstoff gelagert. Die ausreichende Anzahl von PBMC zur Durchführung des Assays nach zwei Tagen Zellkultur erhalten. Im Wesentlichen werden die Zellen zunächst mit phytohemmaglutinin (PHA) inkubiert. Nach 24 h Inkubation wird das Medium durch eine PHA-freien Kulturmedium für zusätzliche 24 Stunden vor der Zellaussaat und OPN-Behandlung ersetzt. Zellen werden dann spektroskopisch ihre Reaktionen auf Somatostatin und Isoproterenol, die jeweils zu aktivieren und Gi Gs-Proteine durch ihre verwandten Rezeptoren gescreent. Sowohl Somatostatin und Isoproterenol gleichzeitig mit integrierter Fluidik-System injiziert und die Reaktionen der Zellen werden für 15 min überwacht. Der Assay kann mit frischem oder gefrorenem PBMCs durchgeführt werden und das Verfahren wird in 4 Tagen abgeschlossen.
Idiopathische Skoliose ist eine Fehlstellung der Wirbelsäule unbekannter Ursache in der Regel als eine seitliche Krümmung größer als 10 Grad begleitet von einer Wirbelrotation 1 definiert. Die Krankheit betrifft 4% der pädiatrischen Population und wird am häufigsten im Alter zwischen 9 und 13 Jahren zwischen 2,3,4 diagnostiziert. Die Diagnose ist in erster Linie der Ausgrenzung und erst nach Ausschluss anderer Ursachen von Wirbelsäulenverformung, wie etwa Wirbelfehlbildung, neuromuskuläre Erkrankungen oder syndromale gemacht. Traditionell wird die trunkal Asymmetrie von Adams Vorbeugen Test ergab, und mit Skoliometer während der körperlichen Prüfung 5 gemessen. Die Diagnose kann dann durch radiologische Beobachtung der Kurve und der Winkelmessung unter Verwendung des Cobb-Methode 6 bestätigt werden.
Einmal diagnostiziert, ist das Hauptanliegen für Ärzte in der Verwaltung skoliotischen Kinder, ob die Kurve weiter voran. Tatsächlich ist der Kurvenverlauf oft unvorhersehbar undist häufiger bei Mädchen als bei Jungen beobachtet, 7. Wenn unbehandelt, kann die Kurve dramatisch fortschreiten, wodurch erhebliche körperliche Missbildung und sogar Herz-Lungen-Probleme. Diese Manifestationen lebensbedrohlich werden, wenn die Kurve 70 ° 8,9 übersteigt. Die aktuellen Behandlungsmöglichkeiten zu verhindern oder zu stoppen Kurvenverlauf sind Verstrebungen und Chirurgie. In der Regel ist für die Reizkurven zwischen 25-40 ° empfohlen, während der Operation ist für Kurven größer als 45 ° oder reagieren nicht auf Verstrebungen vorbehalten.
Ungefähr 10% der Kinder mit idiopathischer Skoliose diagnostiziert Kurvenverlauf erfordern korrigierende Eingriffe 10. Derzeit gibt es keine bewährte Methode oder Test zur Verfügung, um diese Kategorie von Patienten zu identifizieren. Dementsprechend werden alle Kinder diagnostiziert, mehrere Röntgenaufnahmen über mehrere Jahre unterzogen, in der Regel, bis sie Skelettreife zu erreichen. Es wird geschätzt, dass die typischen Patienten mit Skoliose wirdetwa 22 radiologischen Untersuchungen über einen Zeitraum von 3 Jahren 11. Wegen der möglichen Gefahr der Mehrfachröntgenuntersuchungen, die alternative Ansätze, durch die Durchführung der Prognose der idiopathischen Skoliose ohne dass Kinder auf ionisierende Strahlung sind stark erwünscht. Mit der Absicht, diesen Bedarf haben wir vorher eine zellbasierte Screening-Test entwickelt als prognostischer Test, um die asymptomatischen Kindern früher erkennen die Gefahr der Entwicklung idiopathischen Skoliose. Der Test sagt die klinischen Ergebnisse in beiden betroffenen Kinder asymptomatisch und durch Untersuchung der Funktionszustand der Gi-Proteine und Klassifizieren von Kindern in drei Funktionsgruppen (FG1, FG2 und FG3) entsprechend dem Grad der maximalen Reaktion auf Stimulation 12 Gi-Protein, wie durch CDS gemessen -basierten System. Dieses System wird weitgehend verwendet, um die Signaltransduktion durch G-Proteine in verschiedenen Zelltypen 13,14,15,16 beurteilen. Es liefert Informationen über dieGesamt integriert Reaktion der Zellen auf die Außenreize durch Messen von Änderungen in der Impedanz nach der Aktivierung von Zelloberflächenrezeptoren. Zellen werden in Mikrotiterplatten ausgesät, die Elektroden enthalten, am Boden der Vertiefungen und das System legt eine kleine Spannung, die extrazelluläre und trans Ströme induzieren. Nach Injektion der Verbindung in den Brunnen, sind Zelloberflächenrezeptoren stimuliert und Signaltransduktion Ereignisse eintreten, die zu zellulären Veränderungen, die den Fluss von extrazellulären und transzellulären Ströme beeinflussen und damit die gemessene Größe beeinflussen. Mit diesem Ansatz werden die Skoliosepatienten und Kinder ein höheres Risiko der Entwicklung von Skoliose sind weniger auf Gi-Protein Stimulation, wenn sie mit gesunden Kontrollpersonen verglichen und die Einstufung auf dem Prozentsatz der Reduktionsgrad relativ zur Kontrollgruppe basiert. Die Klassifizierungsbereiche sind zwischen 10 und 40% für FG3, 40 und 60% für FG2, und 60 und 90% für FG1 12 befestigt.
<p class = "jove_content"> In jüngerer Zeit haben wir diesen Ansatz zeigt, dass die drei funktionellen Gruppen eindeutig entsprechend dem Profil des Ungleichgewichts zwischen Abhängigkeit und Gi Gs Stimulation unterschieden werden modifiziert. Tatsächlich fanden wir, dass als Reaktion auf Stimulation Gi überwog in FG3, während keine offensichtliche Ungleichgewicht in FG2 beobachtet. Im Gegensatz dazu zeigten FG1 Vorherrschaft für die Reaktion auf Gs Stimulation. Darüber hinaus haben wir den Beweis, dass die Patienten FG2 gehören, sind mehr an der Gefahr der fortschreit bis zur Operation benötigen 17 vorgesehen. Die Präzision dieser Einstufungstest weiter durch den Nachweis einer Differenz Wirkung von Osteopontin (OPN) auf Gi Reaktion auf Stimulation unter funktionellen Gruppen verbessert.Hier dokumentieren wir die einzelnen Schritte der experimentellen und analytischen Verfahren dieser Funktionsprüfung, wie sie derzeit in unserem Labor durchgeführt.
Wir haben eine detaillierte Prozedur eines zellbasierten Prognosetest für idiopathische Skoliose, die für mononukleare periphere Blutzellen (PBMCs) wurden frisch isolierte oder konservierte für bis zu einem Jahr in flüssigem Stickstoff eingefroren beschrieben. Da mit frisch isolierten PBMCs ist umständlich beim Testen große Anzahl von Personen wurde das Verfahren mit gefrorenen PBMCs, die eine praktische Alternative in der klinischen Einstellung bieten vorgestellt. Doch Probleme mit Zellverklumpung nach dem Auftauen wurden die auftreten, wenn gefrorene PBMCs wurden ursprünglich verwendet, was manchmal zu Inter-Assay-Variabilität. Um Assay-Reproduzierbarkeit zu maximieren, empfehlen wir, die Vermeidung von Frost-Tau-Zyklus und mit der gefrorenen Probe nur einmal. Das Verfahren ist sehr einfach und ermöglicht eine genaue Erfassung von defekten Gi-Protein-Funktion in einer kurzen Zeit. Mit diesem Verfahren können asymptomatisch und skoliotischen Kinder leicht eingestuft werden, ihre klinischen Ergebnisse besser vorherzusagen, ohne Gefahr für ihre Gesundheit. HoWever, bei der Durchführung Einstufung nach dem Grad der maximalen Reaktion auf Gi-Stimulation im Vergleich zu den gesunden Kontrollpersonen 12, mehrere Anforderungen für die Kontrollpersonen sollten erfüllt werden. In der Tat, um einen angemessenen Vergleich Kohorte haben, die Kontrollpersonen müssen Alter und Geschlecht abgestimmt sein, nicht auf jede Art von Medikamenten zu sein, und bieten privaten Informationen wie Vergangenheit einzelne / familiäre Krankengeschichte. Diese Anforderungen können ein wichtiges Hindernis für die Einstellung von Kontrollpersonen darstellen. Daher Klassifikation durch Ausführen der Grad der Ungleichheit zwischen Ansprechen auf Gi und G-Protein-Stimulation bei demselben Individuum ist ideal, um die Notwendigkeit der Verwendung von Steuersubjekten zu beseitigen.
Die Verwendung der CDS-basierten System, um dieses Prognosetest durchzuführen ist im Hinblick auf gleichzeitig eine Gi-und Gs-vermittelte Zellreaktionen im gleichen Assay signifikant. Obwohl viele Patienten ohne Uhr klassifiziert werdenbiguity mit der für diesen Test festDynamikBereich, eine kleine Anzahl von Patienten werden Werte an der Grenze der Bereiche zeigen, wie die Ergebnisse des vorliegenden Berichts dargestellt. Diese Personen zu unterscheiden, haben wir die Bewertung der Wirkung von OPN auf Gi Reaktion auf Stimulation durch den Nachweis, dass OPN induziert eine differentielle Wirkung auf Gi-vermittelte zelluläre Antwort auf die drei funktionellen Gruppen eingeführt. Tatsächlich haben wir festgestellt, dass in Gegenwart von OPN, Gi Antwort auf Erhöhungen der Stimulations FG1, FG2, während es in und FG3 abnimmt, in einem höheren Ausmaß in FG2. Trotz der hohen Kosten von OPN ist die Verwendung dieses Chemokin wichtig, eindeutigen Fällen zu unterscheiden, und somit die Genauigkeit der Klassifizierung Assay. Hat dieser Test jedoch den Nachteil, daß ein Minimum von 1,5 × 10 5 Zellen pro Vertiefung erforderlich ist, um die zelluläre Antwort mit der CDS-basierten System unter unseren experimentellen Bedingungen beobachtet. Bestimmte Patientenproben nicht eine ausreichende Anzahl von habenZellen getestet werden. In diesem Fall ist es notwendig, die Patienten für weitere Blutentnahme, die für die Medizin-und Laborpersonal besorgniserregend für Familien und frustrierend sein kann zu erinnern. Prospektive Studien werden in unserem Labor geplant, um dieses Problem anzugehen.
Dennoch setzt das aktuelle Protokoll auf einfache und bewährte Methoden, um Zellen herzustellen, während der Tests mit einem validierten markierungsfreie System 13, 14, um Antworten der Zellen zu überwachen automatisiert. Die Testplattform ist relativ preiswert, wenn sie mit genetischen Plattform für die Prognose von anderen Krankheiten verfügbar verglichen. Auch die Kosten für alle Einwegmaterialien, einschließlich der Blutsammelröhrchen, Tipps, die besondere Elektroden Mikrotiterplatten, sowie konische und Eppendorf-Röhrchen, nicht sehr teuer ist und bei weniger als 3.000 $ geschätzt, um eine Prüfung auf etwa tausend Patienten abzuschließen. Obwohl diese Schätzung nicht enthalten vor allem Kosten für die Vorbereitung von Probenund die Durchführung der Prüfung, bleibt dieser Test deutlich günstiger als Next-Generation-Sequencing-Plattformen. Bemerkenswert ist nicht nur die Kosten gegenüber genetischen Plattformen, aber insbesondere auf dem Gebiet der AIS verwandt ist, ist die Kosten für radiologische Bildgebung verbunden. Heute sind mehr als eine Million Kinder in den USA etwa 100.000 Kinder in Kanada mit idiopathischen Skoliose diagnostiziert, und die Gesamtkosten der Diagnose und Überwachung von Kindern, die von der Skolioseröntgenaufnahme als 2,5 Milliarden Dollar pro Jahr in Nordamerika. Somit wäre zu erwarten zellbasierten Assay-Verfahren für Routineuntersuchungen und Überwachung von Kindern mit idiopathischen Skoliose ohne Gesundheitsrisiko und kostengünstiger zu sein.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus La Fondation Yves Cotrel de l'Institut de France, Paris, Frankreich (Dr. Moreau) unterstützt wird, die kanadischen Institutes of Health Research (Grant PP2-99466 Dr. Moreau) und Fourth Dimension Spine LLC , New York, USA (Forschungsstipendium an Dr. Moreau).
Materials | |||
RPMI | Wisent, Inc | 350-005-CL | |
FBS | Therno Scientific Hyclone | SH3007103 | |
DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17144003 | |
Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
Phytohemagglutinin | Invitrogen (Gibco) | 10576-015 | |
Recombinant Human Osteopontin | R&D Systems, Inc | 1433-OP/CF | |
Somatostatin | Tocris | 1157 | |
Isoproterenol | Tocris | 1743 | |
PBS | Wisent, Inc | 311-010-CL | |
Sterile pipette tips | Axygen Scientific | 301-06-451 | |
Sterile Eppendorf tubes | Ultident | 24-MCT-150-C | |
50 ml conical tubes | VWR International | 89039-658 | |
Cellkey small sample 96W microplate | Molecular Devices | 1026496 | |
Cellkey tips | Cybio | OL3800-25-559N | |
Precut pierceable seals | Excel Scientific, Inc | XP-100 | |
Equipment | |||
Vicell XR | Beckman Coulter | 731050 | Automated cell counter |
Cell culture hood | Forma Scientific | 1284 | Class II |
Liquid nitrogen storage | Thermo Scientific | CY5093570 | |
Water bath | VWR International | 89032-204 | |
Standard light microscope | Leica Microsystems | DMIL LED | |
Cell culture incubator | Thermo Scientific | 51019557 | 5% CO2 at 37 °C |
Low speed centrifuge | Thermo Scientific | 75004364 | |
Cellkey system | Molecular Devices | 1019185 | CDS-based instrument |