تحبب الخلايا البدينة، والإفراج عن وسطاء حساسية، والمهم في الحساسية، والربو، والدفاع الطفيلي. نحن هنا لشرح تقنيات 1 لتقييم آثار المخدرات والمواد السامة على تحبب، المنهجية المستخدمة مؤخرا لإظهار تأثير مثبط قوي من وكيل مضاد للجراثيم التريكلوسان 2.
الخلايا البدينة تلعب دورا هاما في أمراض الحساسية والمناعة ضد الطفيليات الدفاع. تنشيط مرة واحدة (مثلا عن طريق مثيرة للحساسية)، فإنها degranulate، وهي العملية التي ينتج إيماس من الوسطاء حساسية. التشكيل من تحبب الخلايا البدينة من المخدرات والمواد السامة قد يكون لها آثار إيجابية أو سلبية على صحة الإنسان. وقد تم تشريح وظيفة الخلايا البدينة بالتفصيل مع استخدام مستقعد الخلايا البدينة سرطان الدم الفئران (RBL-2H3)، وهو النموذج المقبول على نطاق واسع من الإنسان الخلايا البدينة المخاطية 3-5. يمكن بسهولة وبشكل موثوق أن تقاس الصاري مكون الخلية الحبيبية والوسيط حساسية β-هيكسوزامينيداز، التي يتم تحريرها خطيا جنبا إلى جنب مع الهيستامين من الخلايا البدينة 6، من خلال رد الفعل مع ركيزة الفلورة، مما أسفر عن كثافة مضان قابلة للقياس في فحص صفيحة ميكروسكوبية التي هي قابلة لل دراسات عالية الإنتاجية 1. نشرت أصلا من قبل نعال وآخرون. 1، ونحن قد تكيفت هذه مقايسة تحبب لفحص سالأدوية و المواد السامة والتظاهر واستخدامه هنا.
التريكلوسان هي وكيل واسع الطيف مضاد للجراثيم التي هي موجودة في كثير من المنتجات الاستهلاكية وعثر عليها لتكون المساعدات العلاجية في الإنسان مرض حساسية الجلد 7-11، على الرغم من أن آلية هذا التأثير غير معروف. هنا علينا أن نظهر مقايسة للتأثير على التريكلوسان تحبب الخلايا البدينة. أظهرنا مؤخرا أن التريكلوسان يؤثر بقوة ظيفة الخلايا البدينة 2. في محاولة لتجنب استخدام مذيب عضوي، يذوب التريكلوسان مباشرة إلى المخزن المؤقت مائي مع الحرارة والتحريك، وتأكيد تركيز الناتجة باستخدام القياس الطيفي للأشعة فوق البنفسجية فيس (باستخدام ε 280 = 4،200 L / M / سم) 12. هذا البروتوكول لديه القدرة على أن تستخدم مع مجموعة متنوعة من المواد الكيميائية لتحديد آثارها على تحبب الخلايا البدينة، وعلى نطاق أوسع، إمكاناتهم حساسية.
الخلايا البدينة وحبيبات غاية الخلايا المناعية المستجيب أن تكون بمثابة الوسطاء الرئيسيين في الربو، والحساسية، والطفيليات الدفاع والتسرطن 13-16. يقيمون في ما يقرب من كل الأنسجة أوعية دموية 15، حيث تخزن بشكل آمن وسطاء حساسية والتهابات في حبيبات هيولية حتى المنشط لdegranulate. تحبب هو إيماس من حبيبات غشاء محدد، مما يؤدي إلى إطلاق وسطاء الصيدلانية الفعالة مثل الهستامين، تريبتاز، و leukotrienes 15. هذه النتائج العملية في الشروع في النوع الأول من تفاعلات فرط الحساسية التي تعتبر بالغة الأهمية في تصاعد الدفاع ضد الطفيليات وكذلك الشروع في استجابات حساسية، الربو، ومسببة للسرطان 15.
الخلايا البدينة والخلايا القاعدية مستقبلات FcεRI، المستقبلات عالية تقارب لالغلوبولين المناعي E (إيج) 17. التعرض لمسببات الحساسية أو مستضد يسبب تجميع عدة مستقبلات FcεRI فريق الخبراء الحكومي الدولي متجهة الى 17، وهذا هو قس يسمى ب "يشابك" من مستقبلات القطعة Fc فريق الخبراء الحكومي الدولي متجهة الذي يبدأ عملية تحبب: سلسلة من الأحداث التيروزين الفسفرة، وتفعيل فسفوليباز C، هروب رأس المال من الكالسيوم من مخازن الداخلية، وتدفق الكالسيوم إلى داخل الخلية 18. هذا التدفق الكالسيوم ضروري للتحبب، و، علاوة على ذلك، يشير الانصهار الحبيبية مع الغشاء قبل أن يتسببوا إيماس الحبيبية 15. تجريبيا، وهو حامل الأيون الكالسيوم يمكن أن تستخدم لنقل الكالسيوم مباشرة عبر غشاء الخلية 19، والذي يتجاوز أساسا عن نقل الإشارة الخطوات من قبل لتدفق الكالسيوم الخطوة 20، والسماح لتحديد مسار هدفا بواسطة مادة سامة على أنها المنبع أو المصب الكالسيوم مما يشير 20.
تحبب يمكن قياسها بسرعة وفعالية من خلال رصد إطلاق سراح β-هيكسوزامينيداز إلى طاف الخلية، والتي يتم تحريرها خطيا من حبيبات جنبا إلى جنب مع الهستامين 6، ولكن أناأسهل بكثير للكشف عن رد فعل بسيط باستخدام انزيم الركيزة وقارئ صفيحة ميكروسكوبية لفحص المنتج الفلورسنت. ويستند هذا الاختبار صفيحة ميكروسكوبية، على النحو المفصل في قسم البروتوكول، بناء على وسيلة قوية ضعت أصلا من قبل نعال وآخرون. 1، التي تقيس انشقاق الركيزة الفلورة 4-ميثيل مبيليفيريل-N-أسيتيل β-D-β-glucosaminide من قبل هيكسوزامينيداز. قمنا بتعديل مقايسة لاختبار آثار المخدرات والمواد السامة، مع تسليط الضوء التريكلوسان هنا. هذا الأسلوب الكمي موثوق تحبب، هو بديل رخيص الثمن، على سبيل المثال، تدفق طرق الكشف على أساس cytometric 21، ولديه القدرة على تقديم نفسه بشكل جيد لفحص عالية الإنتاجية من مجموعة واسعة من الأدوية المضادة للحساسية، وكذلك جهاز المناعة أو المواد الكيميائية المسببة للحساسية. هذه النقطة الأخيرة لها أهميتها ولا سيما في ضوء لعام 2007 تقرير المجلس القومي للبحوث "اختبار السمية في القرن الحادي و21: رؤية وSTRATايجى "( http://www.nap.edu/openbook.php؟record_id=11970 )، الذي يدعو لتطوير اختبارات السموم عالية الإنتاجية التي تستخدم خلية ثقافة للحد من استخدام مكلفة من حيوانات المختبر التقليدية مثل الفئران. بروتوكول تحبب التي وضعتها نعال وآخرون. 1 وتعديلها من قبلنا 2، يستخدم خط الخلية RBL-2H3، الذي هو نموذج مقبولة تماما مثلي إلى الإنسان الخلايا البدينة المخاطية أو قعدات 3-5. (ترد تفاصيل طرق لزراعة الخلايا RBL-2H3 في هاتشينسون وآخرون 22). يمكن أن المرجح أن تتكيف هذا الاختبار إلى أي المرفقة نوع الخلايا البدينة.
التريكلوسان (TCS) هو المضادة للميكروبات واسعة الطيف التي تم استخدامها لأكثر من 30 عاما في المستشفيات، ومنتجات العناية الشخصية، والسلع الاستهلاكية 23،24. طريقة عمل لخاصية مضادة للميكروبات TCS هو تثبيط الحيوي الدهنية حمض، من المحتمل عن طريق تثبيط enoyl-أسيلالناقل البروتين اختزال 25،26. انها وجدت في جميع أنحاء العالم في مجموعة واسعة من المنتجات الاستهلاكية مثل هلام الاستحمام، وغسول اليد ومعجون الأسنان وغسول الفم، وفي صابون اليد بتركيزات تصل إلى 0.3٪ أو 10 ملم 24. وقد أدى الاستخدام الواسع النطاق للTCS في المستويات التي يمكن اكتشافها في البشر و27-29 في الأنهار والجداول 30. وهناك دراسة أجريت من قبل Allmyr وآخرون. أثبتت أن 27 TCS وعناصره موجودة في كل من البلازما واللبن من أمهات المرضعات. الأهم من ذلك، يتم امتصاصه بسهولة TCS في الجلد 31-37. Queckenberg وآخرون. وجد 37 ~ 10٪ من امتصاص ~ 70 ملم TCS كريم في الجلد البشري في غضون 12 ساعة، مما أدى إلى تركيز كبير في الجلد، حيث تتواجد الخلايا البدينة.
وقد تبين TCS سريريا لإدارة الإنسان مرض حساسية الجلد 7-11، ولكن كانت الآلية التي TCS يخفف من أمراض حساسية الجلد غير معروف 38. باستخدام صفيحة ميكروسكوبية الفلورسنت وdetaile مقايسةد في هذا الفيديو، ونحن في الآونة الأخيرة أظهرت أن TCS، بتركيزات منخفضة تصل إلى 2 ميكرون، يخفف من حدة بشكل ملحوظ وظيفة الخلايا البدينة وتحبب، وتوفير تفسير محتمل لهذه البيانات السريرية 2. وبالإضافة إلى تقديم تفسيرا لهذه المعطيات السريرية، النتائج التي توصلنا إليها في بالمر وآخرون. 2 تشير إلى أن TCS تستهدف الجزيئات مما يشير المصب من تدفق الكالسيوم. ونظرا لأهمية الكالسيوم في العديد من إشارات المناعية والعمليات البيولوجية الأخرى، يمكن أن يكون TCS يحتمل أن تكون الآثار السلبية على تشكيلة واسعة من العمليات البيولوجية اللازمة. في الواقع، أظهرت Udoji وآخرون. TCS 39 أن يقمع الخلايا القاتلة النشاط التحللي الإنسان الطبيعي، وظيفة المناعة الفطرية هامة أخرى.
خارج إمكاناته كأداة مساعدة العلاجية لمرض حساسية الجلد (أو، على العكس، باعتبارها immunotoxicant)، قد يكون TCS أيضا اضطرابات الغدد الصماء 40-49. وهكذا، فإن إجراءات واضحة بشأن كيفية إعداد هذه المادة الكيميائية في حل طS من الفائدة لعلماء السموم. لأن TCS هو جزيء صغير مسعور، وغالبا ما تستخدم المركبات العضوية لجعله أكثر قابلية للذوبان في الماء. في معظم الدراسات السمية حيث تم اختبار TCS، وإعداد تشارك انحلال في الماء مع المعونة من المذيبات العضوية مثل الإيثانول، الأسيتون، أو زيت 2،50،51. ومع ذلك، في كثير من الأحيان هذه المذيبات نشطة بيولوجيا أنفسهم، وبالتالي تعقيد تفسير المادة الكيميائية اختبار البيانات 51. في الواقع، وفقا لRufli وآخرون. 52 و 53 آخرين، فمن المستحسن أن حلول اختبار للتجارب السمية المائية يتم إعدادها باستخدام الطرق الفيزيائية على الطرق الكيميائية، ونظرا لإمكانات المذيبات الكيماوية لخلق التحف سمية. لقد أظهرنا سابقا أن TCS يذوب في الإيثانول بنسبة 0.24٪ / الماء (المجلد / المجلد) وsonicated لمدة 30 دقيقة يخفف من حدة RBL الصاري تحبب الخلية 2. وقد تبين الإيثانول بتركيزات أعلى من 0.24٪ إلى تثبيط الخلايا البدينة إدناءnulation 54،55-أمثلة على الآثار المحتملة التباس من المذيبات العضوية على دراسات سمية.
ليس فقط هو أنه من المهم أن تنظر في تأثير المذيبات على الكائن الحي أو الخلايا المستخدمة للدراسة، ولكن أيضا من المهم لرصد تأثير المذيبات الكيميائية على اختبار نفسه. على سبيل المثال، سكاري وآخرون. وجدت أن 51 في تذويب TCS البولي ايثيلين جلايكول (التي توجد عادة في معاجين الأسنان وغسول الفم) ضعفت تأثيرات مضادة للبكتيريا ومضادة للالترسبات في النساء أنثى صحي في حين حل في الزيوت تسبب في خسارة كاملة من وظيفة. ولذلك، فإن قدرة المذيبات المختلفة لتعدل السموم والمخدرات، بما في ذلك TCS، وينبغي النظر في الآثار في تصميم مقايسة. استخدام الزيوت أو المواد المضافة نكهة قد تتداخل مع آثار TCS في مختلف المنتجات 50،51.
في محاولة للقضاء على الحاجة إلى استخدام المذيبات العضوية، ونحن تحسينها لدينا وسيلة لتذويب TCS 2 من خلال القضاء على استخدام وسيلة سول العضويةتنفيس. في هذا البروتوكول، ونحن تذوب حبيبات TCS مباشرة إلى المخزن المؤقت مائي مع الحرارة (≤ 50 ° C)، ومن ثم تحقق من تركيز هذا المخزون TCS بواسطة القياس الطيفي للأشعة فوق البنفسجية فيس. هذه التحسينات ممكنة لأن TCS قابل للذوبان في الماء تصل إلى 40 ميكرومتر ( http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf ) ولقد ثبت على مقاومة التحلل عند تسخينها إلى 50 درجة مئوية ( http:// على / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf ) 56،57. لدينا أيضا فائدة إضافية تتمثل في القياس الطيفي للأشعة فوق البنفسجية فيس، كما TCS وكما هو معروف لاستيعاب بقوة 280 نيوتن متر في 58 مع معامل الانقراض المولي من 4،200 L / مول / سم 12.
هذا البروتوكول يوفر وسيلة بسيطة، لكنها فعالة لإذابة حبيبات TCS في منطقة عازلة من دون المعونة من المذيبات العضوية، بما في ذلك تكاليف منخفضة والتحقق السريعمن التركيز، ويصف قوية الفلورسنت فحص صفيحة ميكروسكوبية لرصد الآثار الكيميائية على تحبب الخلايا البدينة.
في عام 2004، نعال وآخرون. 1 وضع جهاز الاستشعار البيولوجي الخلايا البدينة للاختبار عالية الإنتاجية من تحبب. وهو فحص القوية التي تكيفنا للدراسات TCS لدينا ومفصلة في هذا الفيديو. قبل نعال وآخرون. 1 الفحص، تحبب الخلايا البدينة قد تم تقييمها بشكل روتيني عبر β-هيكسوز?…
The authors have nothing to disclose.
معتمدة LMW وRHK من قبل مدرسة UMaine الدراسات العليا للعلوم والهندسة (GSBSE) الطبية الحيوية؛ كان مدعوما أيضا من قبل RHK مين الزراعية وتجربة محطة غابة. وقدمت تمويلا إضافيا من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (NIH P20-GM103423)، ومين الزراعية وتجربة محطة غابة (جرانت عدد ME08004-10، الفريق الاستشاري المشترك)، وجامعة ولاية ماين ADVANCE ارتفاع المد مركز (NSF المنح # 1008498) ، وبحوث كاتب المنحة الصيدلة / علم السموم من مؤسسة فارما (JAG). نشكر الدكاترة. ديفيد Holowka وباربرا بيرد للمستضد والخلايا. ونحن ممتنون لهينا الهاشمي، اليخاندرو فيليز، وأندرو Abovian للمساعدة بالمعدات وأوامر. هذا هو مين الزراعية والغابات تجربة محطة المنشور رقم 3311.
RBL-2H3 Cells |
ATCC |
CRL-2256 |
The cells we used were a gift, but they are also available from ATCC |
Triclosan/Irgasan |
Sigma |
72779 CAS# 3380-34-5 |
Should be stored in a low humidity environment |
Trypsin |
Gibco |
25300-054 CAS# 3380-34-5 |
|
EMEM |
Lonza |
12-611F |
|
Fetal Bovine Serum |
Atlanta Biologicals |
S11150 |
|
Gentamycin Sulfate |
Lonza Biological Sciences |
17-518 |
|
Albumin, Bovine Serum |
Calbiochem |
12659 CAS# 9048-46-8 |
|
Surfact-Amps X-100 (Triton X-100; 10% solution) |
Pierce |
28314 CAS# 9002-93-1 |
|
HEPES |
J.T Baker |
4153-01 CAS# 75277-39-3 |
|
Magnesium Chloride |
VWR |
BDH0244-500G CAS# 7791-18-6 |
|
D-(+)-Glucose |
Biomedicals |
152527 CAS# 50-99-7 |
|
Potassium Chloride Crystal |
J.T Baker |
3046-01 CAS# 7447-40-7 |
|
Calcium chloride dihyrdate |
Acros Organics |
207780010 CAS# 10035-04-8 |
|
Glycine |
Sigma |
G8898 CAS# 56-40-6 |
|
4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide (4-MU) |
EMD Biosciences |
474502-250MG CAS # 37067-30-4 |
Wrap in foil – is light-sensitive |
Anti-DNP Mouse IgE |
Sigma |
D8406 |
Reagent has concentration of 1 mg/ml. Aliquot 25 µl of reagent into separate microcentrifuge tubes and Parafilm. Store aliquots at -20 °C that are not being used and store aliquot that is being used at 2-8 °C for no longer than 1 month. |
DNP-BSA |
Gift from Dr. David Holowka and Dr. Barbara Baird, Cornell University |
Suggest: life technologies DNP-BSA catalog# A23018 |
|
Calcium Ionophore A23187 |
Sigma |
C75-22-1mg |
Ionophore was made from a powder by adding 400 µl of fresh 100% DMSO into the ionophore vial and is kept at -20 °C Note: we have used the ionophore past its 3 month expiration date successfully |
DMSO |
Sigma |
D2650 CAS# 67-68-5 |
|
Acetic Acid |
VWR |
BDH3094-2 CAS# 64-19-7 |
|
Anhydrous Sodium Carbonate |
Sigma |
222321 CAS# 497-19-8 |
|
Sodium Chloride |
Sigma |
71376 CAS# 7647-14-5 |
|
Hydrochloric Acid |
VWR |
BDH3026 CAS# 7647-01-0 |
|
Reference Buffer, pH 7 |
VWR |
BDH5046 |
|
Reference Buffer, pH 10 |
VWR |
BDH5072 |
|
Reference Buffer, pH 4 |
VWR |
BDH5018 |
|
pH electrode storage solution |
VWR |
14002-828 |
|
Equipment: | |||
Material Name |
Company |
Catalogue Number |
Comments (optional) |
DU 7500 Spectrophotometer |
Beckmann |
No longer sold |
|
Synergy 2 plate reader Uses Gen5 Microplate Data Collection and Analysis Software |
BioTek |
Module S |
|
Hematocytometer |
Hausser Scientific |
3110 |
|
7 x 7 CER HOT/STIR 120 V Combination hot plate/magnetic stir plate |
VWR |
97042-634 |
|
Centrifuge |
Eppendorf |
5430 |
|
Tissue culture water bath |
VWR |
Model# 89032-206 |
|
Tissue Culture biological safety cabinet SafeGARD (TC hood) |
The Baker Company |
Model# SG403A-HE |
|
Tissue culture incubator |
ThermoScientific |
Model# 3598 |
|
Pipetman |
VWR |
Range: P2-P1000 |
|
Balance |
Mettler Toledo |
Model# AG204 |
|
pH meter |
Symphony/VWR |
Model# SB70P |
|
Pipet-Aid |
Drummond Scientific |
4-000-100 |
|
Combitip dispenser |
Eppendorf |
4981 000.019 |
|
Recipes: | |||
Name |
Recipe |
Notes |
|
Acetate Buffer, pH 4.4 |
(1 L)*(0.12 mol/L)*(60 g/mol)*(ml/1.37 g) = 5.3 ml because density of glacial is 1.37 g/ml |
Sterile Filter into autoclaved glass bottle |
|
Substrate (4-MU) |
|
For each experiment, make fresh solution of substrate in acetate buffer (100x dilution), for final concentration of 1.2 mM in acetate buffer |
|
Glycine Carbonate Buffer, pH 10 |
|
Sterile filter into autoclaved glass bottle |
|
Tyrodes (2 L), pH 7.4 |
|
Sterile filter into autoclaved glass bottle |
|
RBL Cell Media |
|
Sterile filter (0.2 mm) into autoclaved glass bottle |
|
Plastic material used: | |||
Material Name |
Company |
Catalogue Number |
Type of Plastic |
200 µl Disposable sterile pipet tips with graduations in 96 rack |
VWR |
53509-009 |
polypropylene |
1,000 µl Sterile aerosol pipet tips with HighRecovery |
VWR |
89003-420 |
polyethylene |
10 µl micro tip low binding sterile |
VWR |
14217-704 |
polypropylene |
Disposable/conical Microcentrifuge tubes for high G-force |
VWR |
20170-038 |
polypropylene |
Disposable/graduated/conical/sterile 50 ml centrifuge tubes with screw caps |
VWR |
21008-178 |
polypropylene |
Disposable/graduated/conical/sterile 15 ml centrifuge tubes with screw caps |
VWR |
21008-103 |
polypropylene |
CELLSTAR Tissue Culture Treated T-25 Flask w/ Filter Cap |
Greiner Bio One |
690175 |
polystyrene |
CELLSTAR Tissue Culture Treated T-75 Flask w/ Filter Cap |
Greiner Bio One |
658175 |
polystyrene |
CELLSTAR 10 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette |
Greiner Bio One |
607180 |
polystyrene |
CELLSTAR 2 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette |
Greiner Bio One |
710180 |
polystyrene |
CELLSTAR 5 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette |
Greiner Bio One |
606180 |
polystyrene |
CELLSTAR 25 ml Paper /Plastic Wrapped Serological Pipette |
Greiner Bio One |
760180 |
polystyrene |
1 cm cuvettes |
N/A |
N/A |
polystyrene |
CELLSTAR, 96W Microplate, Tissue-Culture Treated, Black, with Lid 96-well Plate |
Greiner Bio One |
655086 |
polystyrene |
Combitips |
Eppendorf |
022266501 |
Polypropylene/ polyethylene |