Ein Mikroplatten Assay Chemical Auswirkungen auf die RBL-2H3 Mastzelldegranulation bewerten: Effekte von Triclosan ohne Verwendung eines organischen Lösungsmittels

Mastzellen sind sehr Immuneffektorzellen, die als Schlüssel dienen Mediatoren bei Asthma, Allergien, Parasiten Verteidigung und Krebsentstehung ^13-16 granuliert. Sie in fast jedem vaskularisierten Gewebe ¹⁵ wohnen, wo sie sicher speichern allergischen und entzündlichen Mediatoren in zytoplasmatischen Granula bis aktiviert degranulieren. Degranulation der Exozytose von Membran-gebundenen Granulaten, was zur Freisetzung pharmakologisch aktiver Mediatoren, wie Histamin, Tryptase, Leukotriene und ¹⁵ ergibt. Dieses Verfahren führt bei der Initiierung von Typ I Überempfindlichkeitsreaktionen, die entscheidend bei der Montage Verteidigung gegen Parasiten sowie Initiierung Allergiker, Asthmatiker und krebserregend sind ¹⁵ Antworten.

Mastzellen und Basophilen auszudrücken Fc &egr; RI-Rezeptoren, die mit hoher Affinität Rezeptoren für Immunglobulin E (IgE) ^17. Die Exposition gegenüber einem Allergen oder Antigen verursacht Aggregation mehrerer IgE-Rezeptoren gebundenen Fc &egr; RI ^17, und es ist diese so genannte "Vernetzung" von IgE-gebundenen Fc-Rezeptoren, die die Degranulation einleitet: eine Kaskade von Tyrosinphosphorylierung Ereignisse, die Aktivierung von Phospholipase C, Austausch von Calcium aus internen Speichern und Einstrom von Calcium in die Zelle ^18. Das Calcium-Einstrom ist für Degranulation, und ferner Signale Granulat Fusion mit der Membran vor verursacht Granulat Exozytose ^15. Experimentell kann ein Calcium-Ionophor zur Haltestelle Calcium direkt über die Zellmembran ^19, die im wesentlichen umgeht alle Signaltransduktion Schritte vor der Calcium-Einstrom Schritt ²⁰ verwendet werden, die die Identifizierung eines Weges vorbei durch einen Giftstoff als vor oder hinter Calcium-Signalgebung ^20.

Degranulation können schnell und effektiv durch die Überwachung der Freisetzung von β-Hexosaminidase in Zellüberstand, die linear aus dem Granulat neben Histamin freigesetzt ⁶ gemessen werden, aber ichs viel leichter zu detektieren unter Verwendung eines einfachen Enzym-Substrat-Reaktion und eines Mikroplatten-Lesegeräts zum Testen des fluoreszierenden Produkts. Diese Mikroplattenassay, wie im Protokoll Abschnitt beschrieben, ist auf einem robusten Verfahren ursprünglich von Naal et al. ^1, die die Spaltung des fluorogenen Substrates 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid quantifiziert durch β-Basis Hexosaminidase. Wir haben den Test zu Test Wirkungen von Arzneimitteln und Giftstoffen Änderungsdatum, mit Triclosan hier hervorgehoben. Diese Methode zuverlässig quantifiziert Degranulation, ist eine kostengünstige Alternative zu z. B. Durchflusszytometrie basierende Nachweisverfahren ²¹ und hat das Potenzial, sich gut eignen, um High-Throughput-Screening von einer Vielzahl von Anti-Allergie-Medikamente sowie immunotoxische oder allergene Chemikalien. Dieser letzte Punkt ist besonders wichtig im Hinblick auf die 2007 National Research Council Bericht "Toxicity Testing in das ^21. Jahrhundert: Eine Vision und eine Stratgie "( http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970 ), die für die Entwicklung von High-Throughput-toxikologischen Tests, die Zellkultur zu nutzen, um den kostspieligen Einsatz von traditionellen Labortieren wie Mäusen reduzieren befürwortet. Die Degranulation Protokoll Naal et al. ¹ entwickelt und modifiziert von uns ^2, nutzt die RBL-2H3-Zelllinie, die ein gut akzeptiertes Modell homolog zu menschlichen Schleimhaut Mastzellen oder Basophilen ^3-5 ist. (Methoden zur Kultivierung von RBL-2H3-Zellen werden in Hutchinson et al beschrieben. ^22). Dieser Test könnte wahrscheinlich auf einem angeschlossenen Mastzellen Typ angepasst werden.

Triclosan (TCS) ist ein Breitspektrum-Antibiotika, die für mehr als 30 Jahren in Krankenhäusern, Körperpflegeprodukte und Konsumgüter ^23,24 verwendet. Die Wirkungsweise für die antimikrobielle Eigenschaft TCS ist die Hemmung der Fettsäure-Biosynthese, wahrscheinlich durch Hemmung der Enoyl-AcylCarrier-Protein-Reduktase ^25,26. Es wird weltweit in einer breiten Palette von Konsumgütern wie Duschgel, Handcreme, Zahnpasta, Mundwasser, und in der Hand Seifen in Konzentrationen bis zu 0,3% oder 10 mM ^24. Der flächendeckende Einsatz von TCS hat in nachweisbaren Mengen beim Menschen ^27-29 und in Flüssen und Bächen ³⁰ geführt. Eine Studie von Allmyr et al. Gezeigt, dass ²⁷ TCS und seinen Metaboliten, die sowohl im Plasma und Milch von stillenden Müttern sind. Wichtig ist, dass TCS leicht in die Haut absorbiert ^31-37. Queckenberg et al. Gefunden ³⁷ ~ 10% Absorption eines ~ 70 mM TCS-Creme in die menschliche Haut innerhalb von 12 Stunden, was zu erheblichen Konzentration in der Haut, wo Mastzellen befinden.

TCS wurde klinisch für die menschliche allergische Hautkrankheit ^7-11 verwalten gezeigt, aber der Mechanismus, durch den TCS lindert allergische Hauterkrankungen ist unbekannt ^38. Mit dem fluoreszierenden Mikroplattenassay detailed in diesem Video haben wir vor kurzem gezeigt, dass TCS in Konzentrationen so niedrig wie 2 um, deutlich dämpft Mastzellfunktion und Degranulation und bietet eine mögliche Erklärung für diesen klinischen Daten ^2. Neben der Bereitstellung eine Erklärung für diesen klinischen Daten, unsere Erkenntnisse in Palmer et al. ² legen nahe, dass TCS Signalmoleküle stromabwärts von Calcium-Einstrom zielt. Aufgrund der Bedeutung von Calcium-Signalisierung in vielen immunologischen und andere biologische Prozesse könnten TCS potentiell nachteilige Auswirkungen auf eine Vielzahl von biologischen Prozessen erforderlich. In der Tat zeigte Udoji et al., Dass ³⁹ TCS menschliche natürliche Killerzellen lytische Aktivität unterdrückt, ein weiterer wichtiger angeborenen Immunfunktion.

Jenseits sein Potenzial als therapeutische Hilfe bei allergischen Hauterkrankungen (oder umgekehrt, als immunotoxicant) kann TCS auch eine endokrine Disruptoren ^40-49 sein. So ein klares Verfahren, wie diese Chemikalie in Lösung herzustellen is von Interesse Toxikologen. Da TCS ist ein kleines hydrophobes Molekül werden organische Fahrzeugen häufig verwendet, um es in Wasser löslich. In den meisten Toxizitätsstudien, wo TCS getestet wurde, wurde Herstellung Auflösung in Wasser mit Hilfe eines organischen Lösungsmittels, wie Ethanol, Aceton oder Öl ^2,50,51 beteiligt. Doch oftmals diese Lösungsmittel sind biologisch aktiv selbst erschweren dadurch Interpretation des Tests chemische Daten ^51. In der Tat, nach Rufli et al. ⁵² und andere ^53, empfiehlt es sich, Testlösungen für aquatische Toxizität Experimente werden unter Verwendung physikalischer Methoden auf chemische Verfahren, durch das Potenzial von chemischen Lösungsmitteln Toxizität Artefakte zu erstellen. Wir haben zuvor gezeigt, dass TCS in 0,24% Ethanol / Wasser (v / v) gelöst und 30 min mit Ultraschall behandelt dämpft RBL Mastzelldegranulation ^2. Ethanol bei höheren Konzentrationen als 0,24% wurde gezeigt, dass Mastzellen Degra dämpfennulation ^{54,55-Beispiele} für die möglicherweise verwirren Auswirkungen von organischen Lösungsmitteln auf Toxizität.

Es ist nicht nur wichtig, um die Wirkung von Lösungsmitteln auf den Organismus oder Zellen zur Untersuchung verwendeten betrachten, sondern es ist auch wichtig, um die Wirkung von Lösungsmitteln aus der Prüfsubstanz selbst überwachen. Zum Beispiel Skaare et al. Fanden heraus, dass ⁵¹ Auflösen TCS in Polyethylenglykol (häufig in Zahnpasten und Mundwasser gefunden) geschwächt anti-bakterielle und anti-Plaque-Effekte bei gesunden weiblichen Frauen, während in Auflösung Öle verursacht einen vollständigen Verlust der Funktion. Daher ist die Fähigkeit von verschiedenen Lösungsmitteln zu modulieren Giftstoff und Arzneimittel, einschließlich TCS sollte Effekte in Assays berücksichtigt werden. Verwendung von Ölen oder Geschmack Additive können mit den Auswirkungen der TCS in verschiedenen Produkten ^50,51 stören.

In dem Bemühen, die Notwendigkeit der Verwendung organischer Lösungsmittel zu beseitigen, verbesserten wir auf unsere Methode zum Lösen TCS ² durch den Wegfall der Verwendung eines organischen Solentlüften. In der vorliegenden Protokoll, wir lösen TCS Granulat direkt in wässrigem Puffer mit Wärme (≤ 50 ° C), und überprüfen Sie dann die Konzentration dieser TCS Lager durch UV-Vis-Spektroskopie. Diese Verbesserungen sind möglich, weil TCS löslich ist in Wasser bis zu 40 um ( http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf ) und es wurde gezeigt, um den Abbau zu widerstehen, wenn auf 50 ° C (erhitzt http:// / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf ) ^56,57. Wir haben auch den zusätzlichen Vorteil der UV-Vis-Spektroskopie, wie TCS ist auch bekannt, bei 280 nm stark absorbieren ⁵⁸ mit einem molaren Extinktionskoeffizienten von 4200 L / mol / cm ^12.

Dieses Protokoll bietet eine einfache, aber effektive Möglichkeit, TCS Granulat in einen Puffer zu lösen, ohne die Hilfe eines organischen Lösungsmittels, einschließlich Low-Cost und schnelle ÜberprüfungKonzentration, beschreibt und eine leistungsfähige fluoreszierenden Mikroplattenassay zur Überwachung chemischer Effekte auf Mastzelldegranulation.