우리 연구실은 7 일 된 제브라 피쉬의 애벌레의 여러 가지 행동의 검출에 유용 소설 높은 처리량 자동화 이미징 시스템을 개발했다. 이 시스템은 유충이 환경 독성 물질이나 약품에 노출 된 후 행동의 미묘한 변화를 감지하는 데 사용할 수 있습니다.
우리는 다 차선 접시에 7 일짜리 zebrafish의 유충의 행동 분석을위한 새로운 높은 처리량 이미징 시스템을 만들었습니다. 이 시스템은 파워 포인트 프레 젠 테이션을 통해 유충에 표시됩니다 자발적 행동과 혐오 자극에 대한 반응을 측정합니다. 촬영 된 이미지는 자동으로 색상 채널을 분할 ImageJ에 매크로로 분석되는 배경을 뺀 차선의 개별 애벌레 위치를 식별하는 임계 값을 적용합니다. 우리는 그 수영 속도, 차선의 가장자리 또는 측면에 대한 선호, 휴식 행동, thigmotaxis, 유충 사이의 거리 및 회피 행동을 정량화하기 위해 엑셀 시트에 좌표를 가져올 수 있습니다. 행동의 미묘한 변화는 쉽게 환경 독성 물질이나 약품에 노출 된 후 행동 분석을위한 유용하고, 우리의 시스템을 사용하여 감지됩니다.
제브라 피쉬는 유전 적, 발달 및 행동 과학 1-4 인기 모델이되고있다. 그들은 2-3 일 포스트 수정 (DPF)하여 chorions에서 부화 4-5 DPF에 의해 완벽하게 작동하는 기관을 개발하고, 7 DPF 5,6에 의한 행동의 큰 숫자를 나타냅니다. Zebrafish의 유충은 이상적 때문에 그들의 작은 크기 7,8의 높은 처리량 분석에 적합합니다. 소프트웨어 애벌레와 성인 zebrafish의 9-14의 행동의 자동 분석을위한 상업적으로 사용할 수 있습니다. 그러나,이 소프트웨어는 비싼 멀티 잘 접시에 zebrafish의 애벌레의 복잡한 행동을 측정하기위한 제한된 옵션이 있습니다.
우리가 설정하고 7 DPF의 zebrafish의 애벌레 15,16 다른 행동의 수를 정할 수있는 저렴 소설 높은 처리량 이미징 시스템을 만들었습니다. 시스템의 수에 배아 노출 후에 저희가 신속하고 효율적으로 미묘한 행동 이상을 테스트 할 수 있습니다제약 및 환경 독성 물질 16-18.
시스템 캐비닛의 상단에 집이 디지털 카메라 나무 캐비닛을 사용하여 만들어졌습니다. 카메라는 노트북이 15 위로 향하도록 화면 배치 캐비닛의 바닥에 아래로 직면 해있다. 시간 경과 영상은 차선 애벌레의 위치를 캡처하는 데 사용됩니다. 애벌레는 노트북 화면의 상단에 위치하는 네 개의 멀티 잘 또는 다중 차선 번호판에 수납 할 수 있습니다. 우리는 애벌레의 가장자리 (thigmotaxis) 15,17쪽으로 멀리 이동 (회피)와 수영 응답 혐오 자극으로 파워 포인트 프레 젠 테이션을 사용합니다. 이미지는 자동 매크로, 색상 채널을 분할 배경 빼기 및 개별 유충을 식별 할 수있는 임계 값을 적용하는 데 사용되는 ImageJ에로 가져올 수 있습니다. 좌표는 각 이미지의 각 유충에 대해 나열하고 우리가 회피 thigmota을 계량하는 데 사용 엑셀 파일에 삽입 할 수 있습니다XIS 행동, 물고기 거리는 물고기, 속도, 나머지 16 량을 수영.
우리는 지속적으로 새로운 행동 분석을 개선하는 동안, 그것은 항상 회피 zebrafish의 유충 15 thigmotaxis 동작의 검출에 유용하고있다. 많은 시련이 같은 사용 자극의 색으로, 분석의 결과를 최적화하기 위해 수행되었다, 레인 당 유충, 행동 분석의 길이 이상적인 숫자입니다. 이전에, 우리는 멀티 웰 플레이트 (6 또는 12 우물) 15,17,18를 사용했습니다. 그러나 최근에 우리는 우리가 하나의 분석 16 (그림 5)의 행동 조치의 큰 숫자를 수집 할 수 있도록 유충 큰 수영 공간을 만들 수있는 새로운 차선 형을 만들었습니다. 다른 수정은 파워 포인트 예의 B의 변형 (분석의 변경 이동이나 길이) 및 (우리는 또한 더 좁은 골목길 금형을)를 사용 레인의 크기를 이용하실 수 있습니다.
현재이 높은 처리량 자동화 시스템은 zebr의 행동의 넓은 범위를 측정 할 수있는 고유 한 기능입니다같은 속도, 회피, 다른 애벌레에 근접, 멀티 레인 접시에 thigmotaxis과 동시에 afish의 애벌레. 결과를 신속하게 얻을 수 있으며 유충의 큰 숫자는 영상의 시간에 분석 할 수 있습니다. 시스템이 설정 구축 저렴하고 빠르고 쉽게 둘 수 있습니다. 이 시스템의 한계는 3-D 움직임 zebrafish의 유충에서 평가 할 수없는 것입니다. 성인 zebrafish의 추적 자동화 시스템은 3-D 기능을 가지고 있으며 이러한 이동 또는 아래로 물 열 10,19에서와 같은 행동의 넓은 범위를 식별 할 수 있습니다. 또 다른 한계는 우리의 이미징 시스템은 현재 비디오 속도에서 높은 처리량 분석을 위해 최적화되지 않는 것입니다. 낮은 해상도 15 카메라를 설정할 때 동영상 속도 이미징이 가능하지만,이 하나의 플레이트에 분석을 제한합니다.
새로 만든 "레인"방법을 사용하여, 분석의 여러 부분은 정확한 방법으로 실행해야 할 필요가 있었다. T의 유충을 배치 할 때그는 차선, 그것은 플레이트는 노트북 화면의 상단에 위치 할 때까지 액체의 수준이 매우 얕은 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 차선 액체의 너무 많이 있다면, 유충 판의 주변으로 탈출합니다. 또한, 아가로 오스에 금형을 삽입 할 때,주의가 매우 느리게 형을 낮추기 위해주의해야합니다. 형이 너무 빨리 넣으면 거품 아가 형성되고 추가 유충으로 이미지 J 매크로에 의해 식별됩니다. 그것은 아가로 오스 레인도 약간 거품이 있다면, 그것은 새로운 것들을 만들기 위해 최선 것이 좋습니다.
미래에, 우리는 zebrafish의 애벌레 학습 등의 복잡한 행동을 분석하고 학습이 초기 개발에 독성 물질 및 의약품에 노출에 의해 영향을받을 수있는 방법을 조사하기 위해 행동 분석을 최적화하고 싶습니다. 우리는 현재 행동 결과 뇌 영역을 결정할 촉진 할 수있는 학습 행동을 분석하는 데 유용 할 수 있습니다 분석에 노력하고 있습니다개발하는 동안 특정 독성 물질이나 약품에 의해 영향을 미쳤다. 자동화 된 분석은 zebrafish의 유충 (20)이 분석의 동작을 배우는 것이 다 차선 접시에 강력한 회피 반응을 사용하여 높은 처리량 검사를 위해 수정할 수있는 수 있습니다 측정하기 위해 개발되었습니다.
우리는이 행동 분석은 의약품 및 독성 물질의 다수의 발달 효과를 테스트하기 위해 미래 연구에 사용될 수 있다고 제안한다. 이러한 연구는 특정 위험 요소에 대한 풍부한 정보를 제공하고 임산부와 어린이를위한 더 나은 건강 및 안전 지침을 설정에 기여하는 것이다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 행동 분석의 최적화에 도움 숀 Pelkowski 감사합니다. 이 작품은 아동 건강 및 인간 발달의 국립 연구소, R01 HD060647 및 환경 건강 과학의 국립 연구소, F32 ES021342 및 R03 ES017755에 의해 지원되었다.
Reagent | |||
Instant Ocean | That Pet Place | 198262 | |
Agarose | Fisher | BP1356-100 | |
Methylene Blue | That Pet Place | 214325 | |
Equipment | |||
One well plates | Fisher | 12-565-493 | |
Digital camera | Canon | EOS Rebel T1i | |
Imaging Cabinets | WoodCraft Towers | ||
Laptops | Acer Aspire | Any is good as long as it has a 15.6 in. LCD screen with 1366 x 768 pixel resolution and a brightness of 220 cd/m2. | |
Camera Lens | Canon | EF-S 55 – 250 mm f/4.0 – 5.6 IS zoom lens | |
Plastic diffuser | Pendaflex | 52345 | |
Software | |||
PowerPoint 2010 | Microsoft | ||
ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
Excel 2010 | Microsoft | ||
Statistical software | SPSS 20 |