Automatizados análisis de comportamiento de alto rendimiento en larvas de pez cebra

1. Recolección de embriones de pez cebra y provocar larvas Pyrex platos de cristal con hierba "falso" (realizado en lana verde) (Figura 1) se deben insertar en los tanques en la madrugada y se dejan en durante dos horas con el fin de recoger los embriones de pez cebra. Los platos de vidrio que contienen los embriones se vierte sobre un tamiz de mano y se aclararon con agua desionizada. Los embriones se deben cultivarse en agua huevo. El agua de huevo contiene 60 mg / L de Instant Ocean en agua desionizada y 0,25 mg / l de azul de metileno, que se utiliza como un inhibidor de moho. Dependiendo de la hipótesis del experimento individual, los embriones pueden ser tratadas inmediatamente o durante etapas específicas de desarrollo utilizando sustancias tóxicas o productos farmacéuticos. Las sustancias tóxicas y productos farmacéuticos se disuelven habitualmente en DMSO (a una concentración de 1000 X) y se deben diluir aún más directamente en el medio de agua de huevo. Durante el tratamiento de embriones y larvas con productos farmacéuticos o sustancias tóxicass, las larvas y embriones puede ser alojado en platos Petri profundas a una densidad de alrededor de 50 a 60 larvas por cada 50 ml hasta los análisis de comportamiento en 7 dpf (solución del agua del huevo se debe cambiar por lo menos cada dos días para evitar el crecimiento de hongos / bacterias a partir de embriones muertos). 2. Preparación de los moldes de Análisis del comportamiento Especialmente desarrollado moldes de plástico que miden 11,7 cm x 7,6 cm x 5 mm se construyó por encargo de la casa. Se necesitan los moldes para crear carriles utilizando agarosa que se vierte en placas de plástico así individuales de Thermo Scientific. El único pozo medida placas 12,4 cm x 8,1 cm x 1,2 cm. Los moldes contienen cinco carriles en la que los lados están inclinados en 60 °. Los carriles en los moldes son de 3,5 mm de alto con una base de 18 mm en la parte superior, que es la más amplia, mientras que la anchura del fondo es de 14 mm. Hay una brecha de 4 mm entre los carriles en el molde (Figura 2). Para preparar los carriles vierten 50 ml de agarosa fundida (0,8% de agarosa en desionizard agua con 60 mg / L Instant Ocean) en una sola placa así. El molde entonces se debe colocar muy lentamente en la parte superior de la agarosa líquido para eliminar cualquier formación de burbujas y se puede quitar cuando la agarosa se haya enfriado (que tarda aproximadamente 45 min). Los carriles de agarosa deben hacerse no antes de un día antes del experimento conductual se va a ejecutar (para evitar la agarosa seque) Las pistas se pueden almacenar a temperatura ambiente con las tapas de los platos para un máximo de aproximadamente 36 horas. Los carriles de agarosa se deben utilizar solamente para un experimento y luego deben ser desechados. 3. Captura de imagen Hasta 20 larvas se colocan en cada carril de las placas. Típicamente 5 larvas por carril se utilizan para facilitar el seguimiento más exacto de la velocidad de nado y para reducir el número de larvas que se necesitan por experimento. Los carriles se pueden llenar con agua de huevo con o sin productos farmacéuticos o las sustancias tóxicas, dependiendo del experimento. Sin embargo, los carriles no deben ser filled todo el camino hasta que se colocan en los gabinetes de imagen, lo que evitará que rebose. Por razones de coherencia, las larvas debe tener un período de aclimatación de diez minutos después de que se colocan en los moldes de agarosa y se colocan en la parte superior de la pantalla del portátil. Mover eficientemente las larvas de la placa de Petri en el carril de agarosa ayudará a reducir el estrés larvas. Esto es más fácil cuando las larvas se alojan en tanques poco profundos o los platos de Petri. Los gabinetes de imagen incluyen una cámara digital Canon utilizada para fotografía de lapso de tiempo y un ordenador portátil. La cámara debe ser colocado en la parte superior del armario y en dirección a la parte inferior del armario, donde un ordenador portátil de pantalla 15,6 pulgadas debe colocarse con la pantalla hacia arriba (Figura 3). Cuatro placas deben colocarse a mano directamente sobre la parte superior de la pantalla del portátil. En este momento los carriles pueden ser rematado con agua huevo o tratamiento químico para que esté a nivel con la parte superior del carril (para eliminar las sombras en los bordes de la lanestesia en las imágenes). Una presentación de PowerPoint se utiliza como un estímulo aversivo para las larvas. En los últimos móviles bolas rojas se mostraron como las larvas de pez cebra en 6 o 12 placas de pocillos múltiples 15,17,18. El PowerPoint actual comienza con un fondo blanco en blanco durante 15 minutos, seguido de 15 minutos de una barra roja en movimiento en la mitad superior de la placa (Figura 4). A fin de eliminar las larvas de sobrecalentamiento, lo mejor es comprar un ordenador portátil con una pantalla en la que la temperatura no supera los 28 ° C. Para evitar la evaporación del líquido dentro de los carriles de agarosa, el tiempo de proyección de imagen máxima debe mantenerse a menos de una hora. La cámara digital debe ser programado para fotografía de lapso de tiempo, tomando fotos cada 6 segundos para un total de 300 imágenes por experimento. Sin embargo, la frecuencia y la longitud se pueden ajustar dependiendo del experimento y la cuantificación del comportamiento. En los últimos tiempos prolongados imágenes se emplearon con intervalos más largos entre cada imagen. El camera se puede programar a resolución inferior para las imágenes de vídeo a una velocidad (30 cuadros por segundo). Si bien la resolución más baja limita las grabaciones a una sola placa de múltiples pocillos, las grabaciones de vídeo son apropiados para imágenes rápidas pruebas de natación 15. 4. Análisis de Imagen Las imágenes deben ser abiertos con ImageJ y utilizados con una macro que fue escrito específicamente en el local. La macro divide automáticamente los canales de color para que el color rojo se puede quitar, resta el fondo, se aplica un umbral, e identifica las larvas mediante el análisis de partículas. La macro más reciente de cinco carriles análisis larval es Zebrafish_macro25k. Utilice las instrucciones en la macro para establecer el número de imágenes, color que se debe restar, el umbral de la imagen, etc Después de que todas las imágenes son administrados a través de la ImageJ macro, se mostrará un archivo de resultados y contendrá coordenadas x, y de las larvas individual para cada imagen junto con el número de la imagen y el número de carriles. </li> El archivo de resultados se debe guardar en un formato Excel y ordenadas en base a fondo en blanco contra fondo barra en movimiento y luego el número también. Una plantilla de Excel debe ser usado que tiene ecuaciones construido en la que determina automáticamente la colocación de las larvas en los pozos, la distancia entre las larvas, la velocidad de movimiento y la cantidad de descanso. El modelo más reciente de Excel se crea 25ib en el laboratorio Creton, que está disponible bajo petición. Gráficos que muestran diversos grupos de tratamiento debe ser incorporado en la hoja de Excel, junto con las pruebas t para la comparación entre los grupos de tratamiento y control. Además el análisis estadístico se puede realizar con el programa SPSS.