在斑马鱼幼虫的高通量自动化的行为分析

1。斑马鱼胚胎，并提高幼虫的收集高硼硅玻璃菜与“假”的草（由绿色纱）（ 图1）应在黎明和插入的坦克，离开了两个小时，以收集斑马鱼的胚胎。的玻璃培养皿中的胚胎应浇在一个手持式过滤器中，并用去离子水漂洗。然后应胚胎生长在蛋水。的卵水中含有60毫克/升的去离子水和0.25 mg / L的亚甲基蓝的，这是用来作为防霉剂​​的即时海上活动。 根据个别实验假说，胚胎可以立即或在特定的发展阶段，使用毒物或药物治疗。的有毒物质和药品通常是溶解在DMSO中（在1,000倍的浓度），应进行进一步的稀释，在蛋水介质直接。 在胚胎和幼虫的治疗药品或毒物，幼虫和胚胎可以被安置在深的陪替氏培养皿中在每50毫升的密度为约50-60幼虫，直到7单丝旦（蛋水溶液应该改变至少每隔一天，以避免真菌/细菌生长的行为分析死胚）。 2。准备模具行为分析专门开发的塑料模具测量11.7厘米×7.6厘米×5毫米，在内部构建定制。模具需要创建车道用琼脂糖倒入单井Thermo Scientific的塑料板。单一孔板测量12.4厘米×8.1厘米×1.2厘米。 的模具包含5个车道，在它的两侧是有角度的，在60℃。在模具中的各泳道与碱上面的顶部，这是最宽的，而底部的宽度为14毫米的18毫米3.5毫米高。有4毫米的车道在模具之间的间隙（ 图2）。 为了准备车道融化的琼脂糖倒入50毫升（0.8％琼脂糖去离子D水与60 mg / L的即时海洋）在一个单一的孔板。然后，模具应被放置在非常缓慢的顶部的液体琼脂糖，以消除任何气泡的形成，并可以被删除时琼脂糖冷却（这需要大约45分钟）。 琼脂糖车道应不早于前一天运行行为实验（以避免干燥的琼脂糖）的泳道，可在室温下保存在碗碟上的盖大约36小时。琼脂糖车道应该只被用于一项实验中，然后应被丢弃。 3。图像捕捉可放置最多20个幼虫，每个泳道中的板。通常5幼虫每泳道使用，以便最准确的跟踪游泳速度，并减少每次实验所需要的幼虫数。可填充有蛋水带或不带取决于实验的药物或毒物的泳道。然而，泳道不应为f酶联免疫吸附试验（ELISA），直到它们被放置在成像机柜的所有的方式，这将防止溢出。为了保持一致性，幼虫应该有一个驯化时间的10分钟后，它们被放置在琼脂糖模具定位在笔记本电脑的屏幕的顶部。高效移动幼虫从培养皿琼脂糖车道的，将有助于减少幼虫的压力。这是最简单的幼虫被安置在浅水坦克或培养皿。 成像柜包括佳能数码相机使用时间推移摄影和一台笔记本电脑。摄像机应放置在机柜的顶部，旨在实现了15.6英寸屏幕的笔记本电脑屏幕朝上（ 图3），应放在机柜的底部。四大板块应手工定位的笔记本电脑屏幕上直接。此时车道可以封顶蛋水或化学处理，以便它是级别的顶部车道（以消除阴影的边缘上的升麻醉中的图像）。 使用PowerPoint演示文稿的厌恶刺激的幼虫。在过去移动红球，斑马鱼幼虫在6或12多孔板15,17,18。当前的PowerPoint开始的15分钟，然后15分钟的移动板的上半部分（ 图4）上的红色条的空白白色背景。为了消除，幼虫过热，最好是购买一台笔记本电脑，屏幕温度不超过28°C。为了避免琼脂糖车道内的液体的蒸发，最大成像时间应保持在低于1小时。 数码相机应该被编程为延时摄影，拍照每6秒每实验共300张图片。然而，频率和长度可以调整，根据实验和行为量化。在过去的扩展成像时间被雇用，每幅图像之间使用较长的时间间隔。 CAMER一个可以设置在较低的分辨率进行成像以视频速度（每秒30帧）。虽然较低的分辨率限制到一个单一的多孔板，录音录像适合成像快速游泳赛事15。 4。图像分析 ImageJ的图像应打开并使用内部专门写宏。宏自动分割可以被删除，使红色的颜色的颜色通道，减去背景，应用一个阈值，并确定通过颗粒分析幼虫。五车道幼虫分析是最当前的宏观Zebrafish_macro25k。使用提示宏设置的图像数量，颜色要减去，图像的阈值，等等。 所有的图像后运行通过ImageJ的宏，将显示一个结果文件将包含X，Y坐标个别幼虫为每个影像随着图像数量和车道数量。 </LI> 成果文件应当以Excel格式保存，并根据的空白背景与移动栏背景以及数排序。应使用Excel模板，有方程内置自动确定井安置幼虫，幼虫之间的距离，移动速度，其余金额。最当前的Excel模板25ib创建在Creton实验室，这是可根据要求提供。图应该建立到Excel表显示各治疗组，治疗组和对照组之间的比较用t检验。进一步的统计分析，可以采用SPSS。