Motor transección del nervio y Time-lapse de imágenes de Conductas de células gliales en el pez cebra en vivo
Summary
Aunque el sistema nervioso periférico (SNP) es capaz de reparación después de una lesión significativa, poco se sabe acerca de los mecanismos celulares y moleculares que rigen este fenómeno. El uso directo, el pez cebra transgénico y un ensayo de corte transversal del nervio reproducible, podemos estudiar los comportamientos de células gliales dinámicos durante la degeneración del nervio y la regeneración.
Abstract
El sistema nervioso se describe a menudo como un componente de cableado del cuerpo a pesar de que es un sistema de órgano considerablemente líquido que reacciona a los estímulos externos en una manera estereotipada coherente, mientras que se mantiene la flexibilidad y plasticidad increíble. A diferencia del sistema nervioso central (SNC), el sistema nervioso periférico (SNP) es capaz de reparación significativa, pero sólo han comenzado a comprender los mecanismos celulares y moleculares que rigen este fenómeno. El uso del pez cebra como modelo de sistema, tenemos la oportunidad sin precedentes de estudios de regeneración con par de imágenes in vivo y la manipulación genética. Los nervios periféricos se componen de los axones rodeados por capas de células gliales y el tejido conectivo. Los axones se envainado por myelinating o no myelinating células de Schwann, que son a su vez envuelto en un fascículo por una vaina celular llamado el perineuro. Después de una lesión, los nervios periféricos adultos tienen la notable capacidad de remoHe dañado restos axonal y objetivos re-inervan. Para investigar las funciones de todos los glía periférica en PNS la regeneración, como se describe aquí un ensayo de transección axón que utiliza un láser de colorante bombeado por nitrógeno disponible en el mercado a axotomize nervios motores en el pez cebra transgénico vivo. Se describen además los métodos para acoplar estos experimentos para time-lapse de los nervios lesionados y control. Este paradigma experimental se puede utilizar no sólo para evaluar el papel que el juego glía en la regeneración de los nervios, pero también puede ser la plataforma para elucidar los mecanismos moleculares que gobiernan la reparación del sistema nervioso.
Introduction
El pez cebra se han utilizado ampliamente para estudiar el desarrollo del sistema nervioso a causa de su transparencia óptica y la facilidad de transgénesis, que cuando se combina, para permitir la proyección de imagen espectacular de los comportamientos dinámicos de células en un embrión vivo. Además, dado que el pez cebra y los mamíferos comparten casi todos los genes necesarios para la formación del sistema nervioso, la información celular y molecular recogido en este organismo modelo es directamente relacionar con otras especies de vertebrados. Aunque increíblemente poderosa para los estudios de desarrollo neural, el pez cebra y sus atributos únicos tienen el potencial de también dilucidar los mecanismos que mantienen y reconstruir el sistema nervioso después de la lesión. Larvas de pez cebra mantener su translucidez en los estadios larvales finales de los años y la pigmentación puede ser efectivamente bloqueada, ya sea con el uso de inhibidores farmacológicos de la producción de melanina o mutantes genéticos que carecen de células de pigmento. Por lo tanto, el uso de este organismo modelo para el estudio de lesiones y regeneration en animales mayores es posible y ofrece la oportunidad única de investigar directamente los mecanismos celulares y moleculares que reconstruir el sistema nervioso. En este manuscrito, se describe la forma de perjudicar de manera eficiente y reproducible nervios en el SNP de larvas de pez cebra. Este paradigma de lesión se presta al estudio no sólo la degeneración, sino también las respuestas de glía periférica y células inmunes, así como las interacciones entre estas poblaciones durante la regeneración.
El SNP es una red compleja de nervios motores y sensoriales que es necesario para pasar información entre el sistema nervioso central (SNC) y la piel, músculo y órganos del cuerpo, lo que permite un organismo para interactuar con su entorno y sobrevivir. A lo largo de estos nervios, glía periférica, incluyendo las células mielinizantes y no mielinizante de Schwann y células gliales perineural, así como el tejido conectivo, encierran los axones y en última instancia formar el nervio madura. Lesión de los nervios inicia un proceso known como la degeneración walleriana 10. Este mecanismo de fragmentación axonal, la contratación inmune, limpieza de escombros y la regeneración es muy estereotipada y regulada genéticamente 1. Estudios previos en los sistemas de mamíferos han descrito las funciones de las células de Schwann del nervio durante la degeneración y la regeneración 1, 2, 6, 8. En estos estudios de tejido fijado o cultivo de células, las células de Schwann no sólo macrófagos reclutados al sitio de la lesión para ayudar en la limpieza de escombros, sino también ayudaron en sí mismos la fagocitosis de mielina. Si bien estos estudios han sido muy informativo, nunca tenemos ante respuestas gliales visualizados a la lesión axonal periférica en vivo, en tiempo real, y no hay otros estudios han investigado la relación entre los diferentes tipos de glía periférica durante estos eventos.
Recientemente, varios laboratorios han investigado la degeneración walleriana utilizando el pez cebra y el daño axonal láser mediada similar a lo que se describe aquí <sup> 4, 5, 7, 9. En algunos de estos estudios, los axones sensoriales superficiales se axotomizado en larvas jóvenes utilizando una hecha a la medida, de dos fotones microscopio confocal 4, 5, 9. En otro estudio, que es muy similar a la nuestra, los axones más profundas dentro del nervio motor ventral fueron seccionados en larvas de 5 días de edad mediante un sistema de ablación por láser disponible comercialmente 7. En ambos montajes experimentales, la atención se centró en la degeneración walleriana y ambos axones y células inmunes fueron fotografiados. Para ampliar estos estudios, se describe hiriendo axones motores en larvas de mayor edad, con más maduros, los nervios mielinizados y análisis de la respuesta de toda la glía periférica del nervio asociado durante la degeneración y la regeneración.
Para ello, nos transecto nervios motores de 6 y 7 días después de la fertilización (dpf) larvas y visualizar las respuestas de las poblaciones gliales individuales, así como investigar las interacciones entre esas poblaciones a lo largo de los axones lesionados. Usando tra dobles y tripleslíneas nsgenic que glía periférica etiqueta, incluyendo las células de Schwann y células gliales perineural, así como un marcador de los axones, que utilizan un sistema de ablación por láser disponible comercialmente que consiste en un átomo de nitrógeno bombeado por láser de colorante (longitud de onda 435 nm) conectada a un sistema confocal de disco giratorio para crear transections axón. Este montaje experimental nos permite visualizar, larvas de pez cebra en vivo, dañar la imagen de lapso de tiempo las respuestas de las poblaciones gliales distintos tractos de axones motores periféricos específicos y al daño axonal y su relación entre sí. Este protocolo puede ser adaptado, además, para crear lesiones nerviosas en el pez cebra de diferentes edades, con diferentes líneas de transgénicos o mutantes genéticos para abordar diferentes cuestiones científicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los pasos más importantes de este diseño experimental son: 1) correctamente larvas de montaje para la lesión y posterior de imágenes in vivo y 2) calibrar el láser y la selección de los ajustes de potencia correctos con el fin de crear un corte transversal del nervio limpio que resulta en un daño mínimo del tejido extra- . Para ayudar a asegurar una axotomía exitoso para imágenes in vivo y análisis posterior, monte larvas múltiples, ya sea en platos individuales con fondo de crista…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer al Laboratorio Kucenas valiosa para los debates y quórum Technologies, Inc. para soporte técnico excelente. El trabajo fue apoyado por el Fondo UVa para la Excelencia en Ciencia y Tecnología (FEST) (SK).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Phenylthiourea | Sigma | P7629-100G |
| Finquel Tricaine Methanesulfonate MS-222 | Argent Chemical | C-FINQ-UE-100G |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414-10G |
| Quad CELLview Cell Culture Dishes, Glass Bottom, Sterile, Greiner Bio One | VWR/Greiner | 89125-444 |
| Single well glass bottom Petri dishes 35 x 10 mm, 12 mm thick | Willco Wells | GWSt-3512 |
| MicroPoint Laser System with all components | Andor Technology – purchased through Quorum Technologies, Inc. | 2203-SYS |
| MicroPoint Laser Courmarin dye (435 nm) | Andor Technology | MP-27-435-DYE |
Riferimenti
- Geuna, S., et al. Chapter 3: Histology of the peripheral nerve and changes occurring during nerve regeneration. Int. Rev. Neurobiol. 87, 27-46 (2009).
- Hirata, K., Kawabuchi, M. Myelin phagocytosis by macrophages and nonmacrophages during Wallerian degeneration. Microsc. Res. Tech. 57, 541-547 (2002).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of Embryonic Development of the Zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
- Martin, S. M., O’Brien, G. S., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Wallerian degeneration of zebrafish trigeminal axons in the skin is required for regeneration and developmental pruning. Development. 137, 3985-3994 (2010).
- O’Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (24), e1129 (2009).
- Parrinello, S., et al. EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting. Cell. 143, 145-155 (2010).
- Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury. J. Neurosci. 32, 3898-3909 (2012).
- Stoll, G., Muller, H. W. Nerve injury, axonal degeneration and neural regeneration: basic insights. Brain Pathol. 9, 313-325 (1999).
- Villegas, R., Martin, S. M., O’Donnell, K., Carrillo, S., Sagasti, A., Allende, M. L. Dynamics of degeneration and regeneration in developing zebrafish peripheral axons reveals a requirement for extrinsic cell types. Neural Development. 7, 19 (2012).
- Waller, A. Experiments on the section of the glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog, and observations of the alterations pro- duced thereby in the structure of their primitive fibres. Philos. Trans. R. Soc. Lond. , 423-429 (1849).
