Несмотря на то, периферической нервной системы (ПНС) способна значительным ремонт после травмы, мало известно о клеточных и молекулярных механизмов, которые управляют этим явлением. Использование живых трансгенных данио и воспроизводимые анализа перерезки нерва, мы можем изучать поведение динамических глиальных клеток во время дегенерации и регенерации нервов.
Нервная система часто описывается как проводных компонентов тела, хотя это значительно жидкости системы органов, которая реагирует на внешние раздражители, в последовательном, стереотипно, сохраняя невероятную гибкость и пластичность. В отличие от центральной нервной системы (ЦНС), периферической нервной системы (ПНС) способна значительным ремонта, но мы только начали понимать, клеточных и молекулярных механизмов, которые управляют этим явлением. Использование данио в качестве модельной системы, у нас есть беспрецедентная возможность пару регенеративной исследования с прижизненного изображения и генетических манипуляций. Периферических нервов состоят из аксонов, окруженные слоями глии и соединительной ткани. Аксоны ensheathed по миелинизирующих или не миелинизирующих Шванн клетки, которые в свою очередь завернуты в пучок по сотовому оболочка называется периневрии. После травмы, взрослые периферических нервов имеют замечательную способность Ремове повреждены аксональное мусора и повторного Озарение целей. Для исследования роли всех периферийных глии в регенерации ПНС, мы опишем здесь анализа перерезки аксона, который использует коммерчески доступного азота накачкой лазером на красителе для axotomize двигательных нервов в живых трансгенных данио. Мы также описать методы, чтобы соединить эти эксперименты, чтобы покадровой съемки потерпевшего и контроля нервы. Эта экспериментальная парадигма может быть использована не только для оценки той роли, которую играют в глии регенерации нервов, но также может быть платформой для выяснения молекулярных механизмов, которые регулируют нервные системы ремонта.
Данио рерио широко используются для изучения развития нервной системы, потому что их оптических прозрачность и легкость трансгенеза, что в сочетании, позволяют захватывающий визуализации динамических характеристик ячейки в живом эмбриона. Кроме того, поскольку данио рерио и млекопитающих делать почти все гены, необходимые для формирования нервной системы, клеточные и молекулярные информация, собранная в этой модели организм непосредственно Relatable других видов позвоночных. Несмотря на невероятно мощный для нейронных исследований развития, данио а его уникальные свойства имеют потенциал, чтобы также лучше понять механизмы, которые поддерживают и восстановлению нервной системы после травмы. Данио личинки сохраняют свою прозрачность в конце личиночной стадии и пигментация может быть эффективно блокируют или использование фармакологических ингибиторов производства меланина или генетических мутантов, которые не имеют пигментных клеток. Таким образом, используя эту модель организма для изучения травм и Regeneratиона в старых животных можно и предлагает уникальную возможность непосредственно исследовать клеточные и молекулярные механизмы, которые восстановлению нервной системы. В этой рукописи, мы опишем, как эффективно и воспроизводимо повредить нервы в ПНС личинки данио. Это повреждение парадигма поддается изучению не только дегенерации, но и ответов периферической глии и иммунных клеток, а также взаимодействие между этими группами населения в процессе регенерации.
ПНС представляет собой сложную сеть моторных и сенсорных нервов, которые необходимо передавать информацию между центральной нервной системы (ЦНС) и кожи, органов и мышцы тела, что позволяет организму взаимодействовать с окружающей средой и выжить. Вдоль этих нервов, периферических глии, в том числе миелинизирующих и не миелинизирующих шванновских клеток и периневральной глии, а также соединительную ткань, упаковывают аксонов и в конечном счете образуют зрелый нерва. Повреждение этих нервов инициирует процесс KNown как Wallerian дегенерации 10. Этот механизм аксонов фрагментации, иммунные набора, оформления и мусора регенерации очень стереотипно и генетически регулируется 1. Предыдущие исследования в системах млекопитающих описали роль шванновских клеток в процессе дегенерации нерва и 1 регенерации, 2, 6, 8. В этих исследованиях основных тканей или клеточных культур, Шванн клетки не только работу макрофагов в месте повреждения, чтобы помочь в зазор мусора, но и помогают в себя фагоцитоза миелина. Хотя эти исследования были невероятно информативным, мы никогда раньше не визуализированы глиальных ответов на повреждение периферического аксона в естественных условиях в реальном времени, и никакие другие исследования не исследовали взаимосвязь между различными классами периферической глии во время этих событий.
В последнее время несколько лабораторий исследовали Wallerian дегенерации использованием данио и лазерно-опосредованной травмы аксона подобно тому, что мы описываем здесь <sup> 4, 5, 7, 9. В некоторых из этих исследований, поверхностный сенсорных аксонов были аксотомизированных в молодые личинки использованием индивидуальному заказу, двухфотонные конфокальной микроскопии 4, 5, 9. В другом исследовании, которое очень похоже на наш собственный, более глубокие аксонов в вентральной двигательного нерва были перерезаны в 5 дневных личинок с использованием коммерчески доступной системой лазерной абляции 7. В обоих этих экспериментальных установок, акцент был сделан на Wallerian дегенерация и как аксонов и иммунные клетки были обследованы. Расширить свое присутствие на этих исследованиях, мы описываем ранив двигателя аксонов у пожилых личинки с более зрелыми, миелиновых нервы и анализа характеристик всех нервных соответствующие периферийные глии при дегенерации и регенерации.
Чтобы сделать это, мы секут двигательных нервов в 6 и 7 день после оплодотворения (DPF), личинок и визуализировать ответов отдельных глиальных населения, а также исследовать взаимодействие между этими группами населения по поврежденных аксонов. Использование двойных и тройных траnsgenic линий, которые этикетке периферийных глии, в том числе Шванн клетки и периневральной глии, а также в качестве маркера для аксонов, мы используем имеющиеся в продаже системы лазерной абляции состоящей из атома азота накачкой лазером на красителе (длина волны 435 нм), прикрепленный к вращающемуся диску конфокальной системы создать transections аксона. Это экспериментальная установка позволяет визуализировать живые, личиночной данио, ранить конкретных периферийными Мотор аксонов путей и покадровой изображения ответов различных групп населения к глиальных травмы аксонов и их связь друг с другом. Этот протокол может быть дополнительно адаптирована для создания повреждений нерва у рыбок данио разных возрастов, с разными трансгенных линий или генетических мутантов для решения различных научных вопросов.
Наиболее важных шагов этого эксперимента являются: 1) правильно монтажа личинки за травмы и последующей визуализации in vivo и 2) калибровка лазера и выборе правильных параметров питания для того, чтобы создать чистую перерезки нерва, что приводит к минимальным экстра-повреждение тка…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить Лаборатории Kucenas за ценные обсуждения и кворум Technologies, Inc для превосходной технической поддержкой. Работа выполнена при поддержке Фонда UVA, за выдающиеся достижения в науке и технике (FEST) (SK).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Phenylthiourea | Sigma | P7629-100G |
Finquel Tricaine Methanesulfonate MS-222 | Argent Chemical | C-FINQ-UE-100G |
Low melting point agarose | Sigma | A9414-10G |
Quad CELLview Cell Culture Dishes, Glass Bottom, Sterile, Greiner Bio One | VWR/Greiner | 89125-444 |
Single well glass bottom Petri dishes 35 x 10 mm, 12 mm thick | Willco Wells | GWSt-3512 |
MicroPoint Laser System with all components | Andor Technology – purchased through Quorum Technologies, Inc. | 2203-SYS |
MicroPoint Laser Courmarin dye (435 nm) | Andor Technology | MP-27-435-DYE |