모터 신경 절개와 라이브 제브라 피쉬의 아교 세포 행동의 시간 경과 영상
Summary
말초 신경계 (PNS)가 부상 후 중요한 수리 할 수 있지만, 거의가이 현상을 제어하는 세포 및 분자 메커니즘에 대해 잘 알려져 있습니다. 라이브 형질 전환 제브라 피쉬와 재현 신경 절개 분석하여, 우리는 신경 변성과 재생 중에 동적 아교 세포의 행동을 공부할 수 있습니다.
Abstract
놀라운 유연성과 가소성을 유지하면서, 일관성, 틀에 박힌 방식으로 외부 자극에 반응 상당히 유동성 장기 시스템에도 신경 시스템은 종종 신체의 하드 와이어드 구성 요소로 설명되어 있습니다. 중추 신경계와는 달리 (CNS), 말초 신경계 (PNS)는 중요한 수리를 할 수있다, 그러나 우리는 단지이 현상을 제어하는 세포와 분자 메커니즘을 이해하기 시작했다. 모델 시스템으로 제브라 피쉬를 사용하여, 우리는 생체 내 이미징 및 유전자 조작에 함께 부부 재생 연구에 전례없는 기회를 가질 수있다. 말초 신경은 아교 세포와 결합 조직의 층에 의해 둘러싸인 축삭으로 구성되어 있습니다. 축삭은 perineurium라는 세포 칼집에 의해 다발에 싸여 차례에 슈반 세포를 수초 또는 비 수초에 의해 ensheathed 있습니다. 부상 다음, 성인 말초 신경 레모 놀라운 능력을 가지고적 축삭 파편과 다시 신경을 분포시키다 목표를 손상. PNS 재생에있는 모든 주변 교세포의 역할을 조사하기 위해, 우리는 여기에 살고 형질 전환 제브라 피쉬의 운동 신경을 axotomize하기 위해 상업적으로 이용 가능한 질소 펌프 색소 레이저를 사용하는 축삭 절개 분석을 설명합니다. 우리는 더 이상 부상 및 제어 신경의 시간 경과 영상에이 실험 커플 방법을 설명합니다. 이 실험 패러다임은 아교 세포의 신경 재생에 재생, 그러나 또한 신경계 복구를 제어하는 분자 메커니즘을 해명을위한 플랫폼이 될 수있는 역할을 평가하지하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
제브라 피쉬 때문에 그들의 광학 투명 신경계의 발달을 연구하고 transgenesis의 용이성, 그 결합 할 때, 생활 배아에서 동적 세포 행동의 멋진 영상을 허용하기 위해 광범위하게 사용되어왔다. 제브라 피쉬와 포유류는 거의 모든 신경계 형성이 모델 생물에서 수집 한 세포 및 분자 정보에 필요한 유전자 공유하기 때문에 또한, 다른 척추 동물 종에 직접 논리적 인 사람이어야합니다. 신경 발달 연구를위한 매우 강력한 있지만, 제브라 피쉬와 독특한 속성은 또한 손상 후 신경 시스템을 유지하고 다시 메커니즘을 규명 할 수있는 잠재력이있다. Zebrafish의 유충 늦은 애벌레 단계로 자신의 반투명을 유지하고 색소 침착을 효과적으로 멜라닌 생산 또는 색소 세포가 부족한 유전자 돌연변이의 약물 억제제의 사용도 함께 차단 될 수 있습니다. 따라서,이 모델 생물을 사용하면 부상 및 regenerat을 연구하는세 동물의 이온이 가능하고, 직접 신경 시스템을 다시 세포 및 분자 메커니즘을 조사하는 독특한 기회를 제공합니다. 이 논문에서, 우리는 효율적이고 재현성 zebrafish의 애벌레의 PNS의 신경을 손상하는 방법에 대해 설명합니다. 이 부상 패러다임은 주변 glia의 면역 세포의 반응뿐만 아니라, 재생하는 동안이 인구 사이의 상호 작용도 변성뿐만 아니라 공부에 자신을 준다, 그러나.
PNS는 유기체가 환경과 상호 작용하고 생존 할 수 있도록, 중추 신경계 (CNS)와 피부, 장기와 신체의 근육 사이에 정보를 전달하는 데 필요한 운동 및 감각 신경의 복잡한 네트워크입니다. 이 신경을 따라 수초가 아닌 수초 슈반 세포와 perineurial 아교뿐만 아니라, 결합 조직, 축삭 넣다 궁극적으로 성숙한 신경을 형성하는 등 주변의 glia. 이러한 신경의 손상이 프로세스 K를 시작Wallerian 변성 10 nown. 축삭 분열, 면역 채용, 파편 통관 및 재생이 메커니즘은 매우 틀에 박힌 및 유전자 1 규제이다. 포유류 시스템의 이전 연구는 신경 변성 및 재생 1, 2, 6, 8시 슈반 세포의 역할을 설명했습니다. 고정 된 조직 또는 세포 배양의 이러한 연구에서는 슈반 세포뿐만 아니라 파편 정리에 도움이 상해 사이트에 대식 세포를 모집뿐만 아니라, 수초의 식균 작용 자체 주었. 이러한 연구는 매우 유익하고 있지만, 우리는 실시간으로 생체 내 말초 축삭 손상에 대한 시각 신경교 반응하기 전에 적이없는, 그리고 다른 연구는 이러한 이벤트 기간 동안 주변 교세포의 다른 클래스 사이의 관계를 조사 없다.
최근, 여러 실험실 우리가 여기서 설명하는 것과 유사한 제브라 피쉬와 레이저 매개 축삭 손상을 사용 Wallerian 변성을 조사했습니다 <sup> 4, 5, 7, 9. 이러한 연구의 일부, 피상적 인 감각 축삭은 사용자 지정 내장, 두 광자 공 초점 현미경 4, 5, 9를 사용하여 어린 유충에 axotomized 하였다. 또 다른 연구에서, 이는 우리 자신과 매우 유사하다, 복부 운동 신경에서 깊은 축삭은 상업적으로 이용 가능한 레이저 제거 시스템 7을 사용 오일 오래된 유충에 그었 하였다. 이러한 실험 셋업 모두에 초점을 Wallerian 변성 두 축삭과 면역 세포 군데 있었다있었습니다. 이러한 연구를 확장하기 위해, 우리는 더 성숙한, 유수 신경 및 분석 변성과 재생 동안 모든 신경 관련 주변 교세포의 반응을 함께 오래된 애벌레의 모터 축삭 손상 대해 설명합니다.
이렇게하려면, 우리는뿐만 아니라 손상된 축삭을 따라 이러한 집단 간의 상호 작용을 조사하기로 6 운동 신경, 7 일 게시물 수정 (DPF) 유충을 절개 개별 교세포 집단의 반응을 시각화. 더블, 트리플 TRA를 사용하여그 슈반 세포와 perineurial 아교뿐만 아니라 축삭을위한 마커 등의 라벨 주변 아교, nsgenic 라인, 우리는 구성된 시판 레이저 제거 시스템을 사용 질소 펌프 회전 디스크 공 촛점 시스템에 부착 된 염료 레이저 (파장 435 nm의) 축삭 transections을 만들 수 있습니다. 이 실험 셋업 우리가 서로 축삭 손상과의 관계에 특정 주변 장치 모터 축삭 책자 및 시간 경과 이미지 별개의 폐해 인구의 반응을 손상, 라이브, 애벌레 zebrafish의를 시각화 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 다른 과학적 문제를 해결하기 위해 서로 다른 유전자 변형 라인이나 유전 적 돌연변이로, 다른 나이의 제브라 피쉬의 신경 부상을 만들기 위해 적용 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 실험 설계의 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 : 1) 생체 내 이미징 및 2 부상 이후 제대로 설치 유충) 깨끗한 신경 절개를 만들기 위해 레이저를 교정하고 올바른 전원 설정을 선택하는 최소한의 추가 조직 손상의 결과 . 생체 내 이미징 및 이후의 분석을위한 성공 axotomy을 보장하기 위해, 각각의 유리 바닥 요리 중 하나 또는 칸막이 유리 바닥 접시에 여러 유충을 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 뛰어난 기술 지원을위한 귀중한 토론과 정원 테크놀로지에 대한 Kucenas 연구소에 감사드립니다. 작품은 과학 기술 우수 UVA 기금 (FEST) (SK)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Phenylthiourea | Sigma | P7629-100G |
| Finquel Tricaine Methanesulfonate MS-222 | Argent Chemical | C-FINQ-UE-100G |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414-10G |
| Quad CELLview Cell Culture Dishes, Glass Bottom, Sterile, Greiner Bio One | VWR/Greiner | 89125-444 |
| Single well glass bottom Petri dishes 35 x 10 mm, 12 mm thick | Willco Wells | GWSt-3512 |
| MicroPoint Laser System with all components | Andor Technology – purchased through Quorum Technologies, Inc. | 2203-SYS |
| MicroPoint Laser Courmarin dye (435 nm) | Andor Technology | MP-27-435-DYE |
Riferimenti
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