Vi beskriver hvordan du bruker laser capture mikrodisseksjon (LCM) for å få beriket bestander av hippocampus nevroner eller enkelt nevroner fra frosne deler av den skadde rottehjernen for påfølgende genekspresjonsanalyse ved hjelp av kvantitativ real time PCR og / eller hel-genom mikromatriser.
Langsiktig kognitiv funksjonshemming etter TBI er forbundet med skade-indusert neurodegeneration i hippocampus-en region i den mediale tinninglappen som er kritisk for læring, hukommelse og utøvende funksjon. 1,2 Derav våre studier fokuserer på genekspresjonsanalyse av spesifikke nevronale populasjoner i forskjellige underregioner av hippocampus. Teknikken av laser fangst mikrodisseksjon (LCM), ble innført i 1996 av Emmert-Buck et al., 3 har åpnet for betydelige fremskritt i genekspresjonsanalyse av enkeltceller og beriket populasjoner av celler fra heterogene vev som hjernen hos pattedyr som inneholder tusenvis av funksjonelle celletyper. 4 Vi bruker LCM og en godt etablert rotte modell av traumatisk hjerneskade (TBI) for å undersøke de molekylære mekanismene som ligger til grunn patogenesen av hodeskader. Etter væske-perkusjon TBI blir hjernene fjernet ved forhåndsbestemte tider etter skade, umiddelbart frosset på tørris,og forberedt for seksjonering i en kryostaten. De rottehjerner kan bygges inn i oktober og seksjonert umiddelbart, eller lagres i flere måneder ved -80 ° C før snitting for laser fangst mikrodisseksjon. I tillegg bruker vi LCM å studere effekter av TBI på døgnrytme. For dette, fanger vi nerveceller fra suprachiasmatic kjerner som inneholder master klokke av hjernen hos pattedyr. Her viser vi bruken av LCM å få enkle identifiserte nevroner (skadet og degenereres, fluor-Jade-positive, eller uskadet, fluor-Jade-negative) og beriket bestander av hippocampus nevroner for senere genekspresjonsanalyse av Real Time PCR og / eller hel-genom microarrays. Disse LCM-aktiverte studier har avdekket at den selektive sårbarhet anatomisk distinkte regioner av rotte hippocampus gjenspeiles i de ulike genuttrykk profiler av forskjellige populasjoner av nerveceller innhentet av LCM fra disse forskjellige regioner. Resultatene fra våre encellede studier, derSammenligner vi transcriptional profiler av døende og tilstøtende overlevende hippocampus nevroner, foreslår eksistensen av en celle overlevelse rheostat som regulerer celledød og overlevelse etter hodeskader.
Genekspresjonsanalyse av heterogene vev har alltid vært problematisk;. Dette gjelder særlig i hjernen hos pattedyr, som har ca 5000 forskjellige celletyper 4 Før utviklingen av laser capture mikrodisseksjon (LCM) teknikk, genomisk studier av effekten av TBI in vivo var basert på analyse av genuttrykk i en blandet befolkning av hjerneceller består ikke bare av forskjellige nevrale celletyper, men også for å støtte glial og immunmodulerende celler. De resulterende komplekse genuttrykk profiler innhentet fra disse heterogene vev, og de ofte motstridende mønstre av skade-indusert mobilnettet signaler, kan være en forklaring på svikten i kliniske studier med terapeutiske strategier vist seg effektive i pre-kliniske studier av hodeskader. 5
Å få en klar forståelse av skade-indusert genuttrykk i sårbare bestander av nerveceller fra rat hippocampus, vedtok vi teknikken LCM, først rapportert av Emmert-Buck et al. 3 Deretter endret vi og optimalisert denne mikrodisseksjon teknikk for effektiv fangst av beriket bestander av nevroner og single nevroner for mRNA profilering ved hjelp kvantitativ real time PCR og microarray analyse . For å opprettholde integriteten av mRNA i frosne deler av hjernevev for genomisk analyse, endret vi eksisterende protokoller for å fikse, farging og rask fangst av nerveceller fra frosne rottehjernen seksjoner. For identifisering og isolering av skadde og døende hippocampus nevroner, vi også optimalisert Fluoro-Jade farging teknikk for LCM. Fluor-Jade skiller ikke mellom apoptotiske og nekrotisk celledød. Dermed kan alle typer degenereres nevroner bli oppdaget av denne flekken. 6,7
Her beskriver vi protokollen som brukes i vårt laboratorium for å få bassenger av single dør eller overlever nevroner samt ranker av anriket befolkningenons av forskjellige nevrale celletyper (dvs. CA1-CA3 nevroner for genekspresjonsanalyse etter TBI). Prosedyren for fluid perkusjon hjerneskade utført i vårt laboratorium er beskrevet i detalj i Shimamura m.fl.., 8 og er svært lik den laterale fluidum-perkusjon skade protokoll for mus publisert i Jove etter Alder et al. 9 Siden LCM teknikken har vist seg å ha minimal eller ingen virkning på integriteten av DNA, RNA og protein i vev, er dette et utmerket verktøy for molekylær og protein analyse av definerte celletyper.
Dette LCM teknikken har gjort oss i stand til å gjøre betydelige fremskritt i å forstå de molekylære mekanismene for hodeskader. 8,10,11,12,13 vi var de første etterforskerne å utnytte denne teknikken til å vise at forskjellige underregioner av rotte hippocampus har genuttrykk profiler som korrelerer med deres selektive sårbarhet for skade. Våre undersøkelser viste at vi kunne kvantifisere genuttrykket ved qPCR, fra så få som 10 laser fanget celler og at vi kunne utføre genom-wide microarray analyse fra så få som 600 fangede celler. LCM ville være et verdifullt verktøy i lignende studier av andre områder av hjernen som er kjent for å være innblandet i ulike nevrologiske og nevropsykiatriske lidelser. For eksempel har studier med LCM belyse i patogenesen av Parkinsons sykdom i dopamin neurons av substantia nigra, 14 og hjulpet genom-wide profilering studier av nucleus accumbens, som er involvert i belønning kretser innblandet i substance misbruk lidelser. 15
Neuronal heterogenitet gjenspeiles på genomet nivå 16 og kan bidra til mangel på suksess eksperimentelle behandlinger for TBI i kliniske studier. Dermed er vårt mål å utnytte denne teknikken for å undersøke de kritiske elementene påvirker nevronal overlevelse etter hodeskader. Vårt nylige genom-wide profilering studie av farging og tilstøtende gjenlevende hippocampus nevroner etter TBI foreslo at en cellulær rheostat som reflekterer forholdet uttrykket nivåer av celleoverlevelse til celledød gener regulerer celle skjebne etter hodeskader. Disse pågående studier vil bidra til design og utvikling av Farmakoterapeutisk strategier som kan positivt påvirke celle overlevelse rheostat. Videre har vi i dag bruker LCM å spore og overvåke virkningene av potensielle terapeutiske medikamentelle behandlinger i hippocampus nevroner etter hodeskader. Dermed våre studier viser at gitt forsiktig RNase-frie håndtering teknikker og noenmodifikasjoner av eksisterende protokoller, er det mulig å oppnå høy kvalitet RNA prøver fra LCM for nøyaktig kvantitativ genekspresjonsanalyse.
Men det er noen fallgruver forbundet med LCM teknikker. For eksempel, kan samle bare neuronale celler uten microglia kontaminering være nesten umulig. I pyramidal cellelaget av hippocampus har det blitt anslått at 95% av cellene er nervecellene med 90% av denne populasjonen å være pyramidale celler og 10% interneurons, forlater en liten prosentandel av glial og andre celletyper. 8,17, 18 I våre studier bruker vi Fluoro-jade et fluorescerende fargestoff som spesifikt etiketter bare skadde nerveceller i hjernen vev. En annen flekk som er en markør for GFAP ville være nødvendig å farge microglia. 19 Samle bare Fluoro-jade farget enkelt nevrale organer sikrer en mer homogen befolkning av nerveceller. Et annet vanlig problem som kan kreve feilsøking er at en sirkel er ingent definert når laseren er avfyrt. Hvis dette skjer, er det nødvendig å kontrollere laser innstillinger og justere kraften og varighet som er nødvendig. Likeledes er det viktig å sikre at hetten er plassert flatt på vev og sittende riktig i armen. Med henvisning til LCM tekniske håndboken eller ringe teknisk støtte vil noen ganger være nødvendig. Etter LCM og RNA isolasjon, kvaliteten av RNA alltid vurderes ved hjelp av en Bioanalyzer før enhver genekspresjonsanalyse.
Det finnes flere typer laser capture instrumenter på markedet, inkludert laser cutting (Life Technologies, Leica Microsystems) og laser catapulting (Zeiss) instrumenter. Vår LCM system fungerer godt for å fange et lite antall celler. Andre high-throughput og mer automatiserte systemer kan være mer egnet til å oppnå større antall celler for genomisk og spesielt proteomikk analyser. Faktisk har LCM bruke disse automatiserte systemer stort potensial for analyse av protein uttrykk i identifiserte celler eller beriket bestander av celler. 20 Videre kan LCM lette genekspresjonsanalyse av immunolabeled celler, 21 tillater oss å undersøke genekspresjon i definerte celletyper uavhengig av kompleksiteten i de mest heterogene vev. Dermed er LCM et utmerket verktøy for cutting-edge molekylære studier av ett eller beriket populasjoner av celler.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet er finansiert av R01 NS052532 (til HLH), Moody Foundation, og Institutt for Anestesiologi. Vi takker Laurie Bolding, Christine Courteau Butler og Christy Perry for sin redaksjonelle hjelp, og Christy Perry for layout og god produksjon av alle figurer, tabeller og illustrasjoner.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | |
PixCell IIe Laser Capture Microscope | Life Technologies (Arcturus) | ||
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
RNAqueous Micro- Kit | Life Technologies (Ambion) | AM1931 | |
Agilent 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
Capsure LCM caps | Applied Biosystems | LCM0211/LCM0214 | |
Fluoro-Jade | Histo-chem Inc. | #1FJ | |
Cresyl Violet Acetate | Sigma-aldrich | C5042-10G | |
Xylene (Histological grade) | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
Ethanol 200 proof (Histological grade) | UTMB pharmacy | ||
RNase free barrier pipette tips | Fisher Scientific | 2123635, 212364, 212361, 21-236-2A | |
Arcturus Laser Capture Microdissection system (Life Technologies) Zeiss Laser Microdissection The PALM family Leica Microsystems |