Laser Capture Microdissection van Verrijkt populaties van neuronen of Single Neuronen voor de analyse van genexpressie na traumatisch hersenletsel
Summary
We beschrijven hoe laser capture microdissectie (LCM) om verrijkte populaties van hippocampale neuronen of afzonderlijke neuronen vastgezette gewonden rattenhersenen voor daaropvolgende analyse van genexpressie met kwantitatieve real time PCR en / of hele genoom microarrays verkrijgen.
Abstract
Lange termijn cognitieve beperkingen na een traumatisch hersenletsel wordt in verband gebracht met letsel-geïnduceerde neurodegeneratie in de hippocampus-een gebied in de mediale temporale kwab dat is van cruciaal belang voor het leren, geheugen en executieve functies. 1,2 Vandaar onze studies richten zich op de analyse van genexpressie van specifieke neuronale populaties in verschillende subgebieden van de hippocampus. De techniek van laser capture microdissectie (LCM), die in 1996 door Emmert-Buck et al.., 3 is toegestaan significante vooruitgang in genexpressie analyse van enkele cellen en verrijkte populaties van cellen van heterogene weefsels zoals de hersenen van zoogdieren die bevat duizenden functionele celtypen. 4 We gebruiken LCM en gevestigde rat model van traumatisch hersenletsel (TBI) om de moleculaire mechanismen die de pathogenese van TBI grondslag liggen onderzoeken. Na vloeistof-percussie TBI, zijn hersenen verwijderd op vooraf bepaalde tijden na het letsel, direct ingevroren op droog ijs,en voorbereid voor het snijden in een cryostaat. De rat hersenen kunnen worden ingebed in OCT en doorgesneden direct of enkele maanden opgeslagen bij -80 ° C vóór het snijden voor laser capture microdissectie. Bovendien gebruiken we LCM de effecten van TBI op circadiane ritmes bestuderen. Hiervoor maken we vangen neuronen van de suprachiasmatische kernen dat de meester klok van de hersenen van zoogdieren bevatten. Hier tonen we het gebruik van LCM om enkel geïdentificeerd neuronen (gewonden en degeneratie, Fluoro-Jade-positieve of ongeschonden, Fluoro-Jade-negatief) en verrijkte populaties van hippocampale neuronen voor daaropvolgende analyse van genexpressie te verkrijgen door real time PCR en / of hele-genoom microarrays. Deze LCM-enabled studies hebben aangetoond dat de kwetsbaarheid van anatomisch verschillende gebieden van de rat hippocampus worden in de verschillende genexpressieprofielen van verschillende populaties van neuronen verkregen door LCM uit deze verschillende gebieden. De resultaten van onze single-cell studies, waarbijwe de transcriptionele profielen van aangrenzende sterven en overleven hippocampale neuronen suggereren het bestaan van een celoverleving regelweerstand die celdood en overleving na TBI regelt.
Introduction
Genexpressie analyse van heterogene weefsels is altijd problematisch. Dit geldt met name in de hersenen van zoogdieren, die ongeveer 5.000 verschillende celtypen heeft 4 Vóór de ontwikkeling van de laser capture microdissectie (LCM) techniek, genomische studies de effecten van TBI in vivo zijn gebaseerd op analyse van de genexpressie in een gemengde populatie van hersencellen omvat niet alleen verschillende neuronale celtypen, maar ook ondersteunen gliale en immunomodulerende cellen. Het resulterende complex genexpressie die uit deze heterogene weefsels en de vaak tegenstrijdige patronen van schade geïnduceerde cellulaire signalen kan men redenen niet in studies van therapeutische strategieën effectief gebleken in preklinische studies van TBI. 5 liggen
Om een duidelijk begrip van letsel-geïnduceerde genexpressie te verkrijgen in de kwetsbare populaties van neuronen van de rat heuppocampus, hebben we de techniek van LCM, eerst gemeld door Emmert-Buck et al.. 3 Vervolgens hebben we aangepast en geoptimaliseerd dit microdissectie techniek voor efficiënte vangst van verrijkte populaties van neuronen en enkele neuronen voor mRNA profiling met behulp van kwantitatieve real-time PCR en microarray analyse . Om de integriteit van mRNA in vriescoupes van hersenweefsel voor genomische analyse te behouden, hebben we aangepast bestaande protocollen voor het fixeren, kleuring en een snelle vangst van neuronen uit bevroren hersenen van de rat secties. Voor identificatie en isolatie van gewonde en stervende hippocampale neuronen maar ook geoptimaliseerd Fluoro-Jade kleuring techniek voor LCM. Fluoro-Jade maakt geen onderscheid tussen apoptotische en necrotische celdood. Zo kunnen allerlei degenererende neuronen worden gedetecteerd door deze vlek. 6,7
We beschrijven hier het protocol dat in ons laboratorium om pools van enkele sterven of overleven neuronen en stroken van verrijkt populati te verkrijgenons van verschillende neuronale celtypen (bijvoorbeeld CA1-CA3 neuronen voor genexpressieanalyse na TBI). De procedure voor fluïdum percussie hersenletsel in ons laboratorium is in detail beschreven in Shimamura et al.., 8 en is zeer vergelijkbaar met de laterale fluïdum-percussie schade protocol voor muizen gepubliceerd in Jove door Alder et al.. 9 Aangezien de LCM techniek heeft aangetoond dat weinig of geen effect hebben op de integriteit van DNA, RNA en eiwitten in weefsel, is een uitstekend hulpmiddel voor moleculaire en eiwitanalyse van gedefinieerde celtypes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze LCM techniek heeft ons in staat om aanzienlijke vooruitgang te boeken bij het begrijpen van de moleculaire mechanismen van TBI. 8,10,11,12,13 Wij waren de eerste onderzoekers om deze techniek te gebruiken om aan te tonen dat verschillende subregio's van de hippocampus van ratten genexpressie profielen hebben dat correleren met hun selectieve kwetsbaarheid voor letsel. Onze studies hebben aangetoond dat we genexpressie kwantificeren door qPCR, van zo weinig als 10 laser gevangen cellen en dat we genoom microarray analyse uitvoeren van zo weinig als 600 gevangen cellen. LCM een waardevol instrument in vergelijkbare studies van andere hersengebieden waarvan bekend is dat betrokken is bij diverse neurologische en neuropsychiatrische stoornissen. Bijvoorbeeld, studies met LCM belichten in de pathogenese van de ziekte van Parkinson in dopamine neuronen van de substantia nigra, 14 en geholpen genoomwijde studies profilering van de nucleus accumbens, dat betrokken is bij beloning circuits betrokken in substance misbruik stoornissen 15.
Neuronale heterogeniteit wordt gereflecteerd onder genoomniveau 16 en kan bijdragen aan het gebrek aan succes van experimentele behandelingen voor TBI in klinische trials. Zo, ons doel is om deze techniek te gebruiken om de kritische elementen van invloed zijn neuronale overleving na een traumatisch hersenletsel te onderzoeken. Onze recente genoom profilering onderzoek sterven en aangrenzende overlevende hippocampale neuronen na TBI gesuggereerd dat een cellulaire weerstand dat de verhouding van de expressie van celoverleving weerspiegelt celdood genen lot van de cel reguleert na TBI. Deze lopende studies zullen bijdragen aan het ontwerp en de ontwikkeling van farmacotherapeutische strategieën die een positieve invloed kunnen de overleving van de cel rheostat. Verder hebben we op dit moment gebruik maken van LCM op te sporen en te monitoren van de effecten van mogelijke therapeutische behandelingen met geneesmiddelen in hippocampale neuronen na een traumatisch hersenletsel. Zo, onze studies tonen aan dat gegeven zorgvuldige RNase-vrij behandelingstechnieken en een aantalmodificaties van bestaande protocollen is het mogelijk om hoge kwaliteit RNA monsters van LCM nauwkeurige kwantitatieve analyse van genexpressie.
Maar er zijn een paar valkuilen in verband met LCM technieken. Zo kan het verzamelen van alleen neuronale cellen zonder microglia besmetting bijna onmogelijk. In de pyramidale cellaag van de hippocampus is geschat dat 95% van de cellen zijn neuronen met 90% van deze populatie te piramidecellen en 10% interneuronen, waardoor een klein percentage van gliale en andere celtypes. 8,17, 18 In onze studies hebben we gebruik Fluoro-Jade een fluorescerende kleurstof die specifiek labelt enkel gewonden neuronen in hersenweefsel. Een andere vlek die een merker voor GFAP zou moeten worden microglia vlek. Verzamelen 19 alleen Fluoro-Jade gekleurde enkele neuronale organen zorgt voor een homogene populatie van neuronen. Een ander veel voorkomend probleem is zelfs mogelijk dat het oplossen van problemen is dat een cirkel geent gedefinieerd wanneer de laser wordt afgevuurd. Als dit gebeurt, moet de laser te controleren en de kracht en de duur zo nodig aan. Ook is het belangrijk dat de dop plat op het weefsel en goed in de arm. Verwijzend naar de LCM technische handleiding of bellen technische ondersteuning soms noodzakelijk zijn. Na LCM en RNA isolatie moeten de kwaliteit van het RNA altijd worden beoordeeld met een Bioanalyzer vóór het genexpressieanalyse.
Er zijn verschillende types van laser capture instrumenten die momenteel op de markt, waaronder lasersnijden (Life Technologies, Leica Microsystems) en laser katapulten (Zeiss) instrumenten. Onze LCM systeem werkt goed voor vastleggen van kleine aantallen cellen. Andere high-throughput en geautomatiseerde systemen kunnen meer geschikt voor het verkrijgen van grotere aantallen cellen voor genomische en proteomische analyse bijzonder. Inderdaad, LCM met behulp van deze geautomatiseerde systemen heeft een groot potentieel voor de analyse van protein expressie in cellen geïdentificeerd of verrijkte populaties van cellen. 20 Bovendien kan LCM vergemakkelijken genexpressieanalyse van immunolabeled cellen, 21 waardoor we genexpressie ongeacht onderzoeken in bepaalde celtypen de complexiteit in de meest heterogene weefsels. Zo LCM is een uitstekend hulpmiddel voor cutting-edge moleculaire studies van enkele of verrijkte populaties van cellen.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt gefinancierd door R01 NS052532 (tot HLH), de Moody Foundation, en het ministerie van Anesthesiologie. Wij danken Laurie Bolding, Christine Courteau Butler en Christy Perry voor hun redactionele ondersteuning, en Christy Perry voor lay-out en een uitstekende productie van alle figuren, tabellen en illustraties.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | |
| PixCell IIe Laser Capture Microscope | Life Technologies (Arcturus) | ||
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
| RNAqueous Micro- Kit | Life Technologies (Ambion) | AM1931 | |
| Agilent 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Capsure LCM caps | Applied Biosystems | LCM0211/LCM0214 | |
| Fluoro-Jade | Histo-chem Inc. | #1FJ | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma-aldrich | C5042-10G | |
| Xylene (Histological grade) | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
| Ethanol 200 proof (Histological grade) | UTMB pharmacy | ||
| RNase free barrier pipette tips | Fisher Scientific | 2123635, 212364, 212361, 21-236-2A | |
| Arcturus Laser Capture Microdissection system (Life Technologies) Zeiss Laser Microdissection The PALM family Leica Microsystems |
Riferimenti
- Squire, L. R., Stark, C. E., Clark, R. E. The medial temporal lobe. Annual Review of Neuroscience. 27, 279-306 (2004).
- Bast, T. Toward an integrative perspective on hippocampal function: from the rapid encoding of experience to adaptive behavior. Rev. Neurosci. 18 (3-4), 253-281 (2007).
- Emmert-Buck, M. R., Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
- Bota, M., Dong, H. W., Swanson, L. W. From gene networks to brain networks. Nat. Neurosci. 6 (8), 795-799 (2003).
- Schouten, J. W. Neuroprotection in traumatic brain injury: a complex struggle against the biology of nature. Curr. Opin. Crit. Care. 13 (2), 134-142 (2007).
- Schmued, L. C., Albertson, C., Slikker, W. Fluoro-Jade: a novel fluorochrome for the sensitive and reliable histochemical localization of neuronal degeneration. Brain Research. 751 (1), 37-46 (1997).
- Ye, X., Carp, R. I., Schmued, L. C., Scallet, A. C. Fluoro-Jade and silver methods: application to the neuropathology of scrapie, a transmissible spongiform encephalopathy. Brain Res. Brain Res. Protoc. 8 (2), 104-112 (2001).
- Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression. Mol. Brain Res. 17 (1), 47-61 (2004).
- Alder, J., Fujioka, W., Lifshitz, J., Crockett, D. P., Thakker-Varia, S. Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice. J. Vis. Exp. (54), e3063 (2011).
- Shimamura, M., Garcia, J. M., et al. Analysis of long-term gene expression in neurons of the hippocampal subfields following traumatic brain injury in rats. Neuroscienze. 131 (1), 87-97 (2005).
- Shah, S. A., Prough, D. S., Garcia, J. M., DeWitt, D. S., Hellmich, H. L. Molecular correlates of age-specific responses to traumatic brain injury in mice. Exp. Gerontol. 41 (11), 1201-125 (2006).
- Hellmich, H. L., Garcia, J. M., et al. Traumatic brain injury and hemorrhagic hypotension suppress neuroprotective gene expression in injured hippocampal neurons. Anesthesiology. 102 (4), 806-814 (2005).
- Rojo, D. R., Prough, D. S., et al. Influence of stochastic gene expression on the cell survival rheostat after traumatic brain injury. PLoS One. 6 (8), e2311 (2011).
- Elstner, M., Morris, C. M., et al. Expression analysis of dopaminergic neurons in Parkinson’s disease and aging links transcriptional dysregulation of energy metabolism to cell death. Acta Neuropathol. 122 (1), 75-86 (2011).
- Chen, H., Liu, Z., et al. Genome-Wide Gene Expression Profiling of Nucleus Accumbens Neurons Projecting to Ventral Pallidum Using both Microarray and Transcriptome Sequencing. Front. Neurosci. 5, 98 (2011).
- Lein, E. S., Hawrylycz, M. J., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
- Amaral, D. G., Ishizuka, N., Claiborne, B. Neurons, numbers and the hippocampal network. Prog. Brain Res. 83, 1-11 (1990).
- Zeng, Y. C., Bongrani, S., et al. Effect of long-term treatment with L-deprenyl on the age-dependent microanatomical changes in the rat hippocampus. Mech. Ageing Dev. 79 (2-3), 169-185 (1995).
- Schmued, L. C., Hopkins, K. J. Fluoro-Jade: novel fluorochromes for detecting toxicant-induced neuronal degeneration. Toxicol. Pathol. 28 (1), 91-99 (2000).
- Banks, R. E., Dunn, M. J., et al. The potential use of laser capture microdissection to selectively obtain distinct populations of cells for proteomic analysis– preliminary findings. Electrophoresis. 20 (4-5), 689-700 (1999).
- Fend, F., Emmert-Buck, M. R., et al. Immuno-LCM: laser capture microdissection of immunostained frozen sections for mRNA analysis. Am. J. Pathol. 154 (1), 61-66 (1999).
