외상성 뇌 손상 후 뉴런 또는 유전자 발현 분석을위한 단일 뉴런의 강화 인구의 레이저 캡처 Microdissection
Summary
우리는 정량 실시간 PCR 및 / 또는 전체를 게놈 microarrays를 사용하여 후속 유전자 발현 분석을위한 부상을 쥐의 뇌의 냉동 섹션에서 hippocampal 뉴런 또는 단일 뉴런의 풍부한 인구를 얻기 위해 레이저 캡처 microdissection (LCM)를 사용하는 방법에 대해 설명합니다.
Abstract
외상성 뇌 손상 후 장기인지 장애는 학습, 메모리 및 집행 기능에 대한 중요 중간 측두엽에있는 해마 – 지역의 부상을 유발 neurodegeneration와 연결되어 있습니다. 1,2 따라서 우리의 연구는 특정 neuronal의 유전자 발현 분석에 초점을 해마의 독특한 하위 지역의 인구. Emmert – 벅에 의해 1996 년에 도입 된 레이저 캡처 microdissection (LCM)의 기술, 외., 3 단일 세포의 유전자 발현 분석에 상당한 발전을 위해 허용 드높여 왔습니다 등이 포함 된 포유류의 뇌와 같은 이기종 조직에서 세포의 인구 기능 세포 유형의 수천 4. 우리는 LCM 및 외상성 뇌 손상의 pathogenesis을 기초 분자 메커니즘을 조사 할 외상성 뇌 손상의 잘 설립 쥐 모델을 (외상성 뇌 손상)을 사용합니다. 유체 – 타진 외상성 뇌 손상 후, 뇌는 즉시 드라이 아이스에 냉동, 미리 정해진 시간 이후 부상에서 제거됩니다와 그라 이오 스탯에 sectioning 준비. 쥐 두뇌은 즉시 10월과 sectioned에 포함하거나, -80에서 몇 개월 저장할 수 있습니다 ° C 레이저 캡처 microdissection에 대한 sectioning 전에. 또한, 우리는 circadian 리듬에 외상성 뇌 손상의 효과를 연구 할 LCM 사용합니다. 이를 위해, 우리는 포유류의 뇌의 마스터 클럭을 포함 suprachiasmatic 핵의 뉴런를 캡처합니다. 여기, 우리는 실시간 PCR 및 / 단일 식별 뉴런 (부상 및 degenerating, 플루오로 – 제이드 – 긍정적, 또는 손상되지 않은, 플루오로 – 제이드 – 제외) 및 후속 유전자 발현 분석을위한 hippocampal 뉴런의 풍부한 인구를 확보 할 수 LCM의 사용을 보여줍니다 또는 전체 – 게놈 microarrays. 이러한 LCM 가능 연구는 쥐 해마의 해부학 고유 한 영역의 선택적 취약성이 뚜렷한 지역에서 LCM 얻은 뉴런의 다른 인구의 서로 다른 유전자 발현 프로파일에 반영하는 공개했다. 우리의 단일 셀 연구, 어디에서 결과우리는 죽음과 인접 hippocampal 뉴런을 생존의 전사 프로파일을 비교 외상성 뇌 손상 후 세포 죽음과 생존을 조절 세포 생존 가감 저항기의 존재를 권장합니다.
Introduction
이종 조직의 유전자 발현 분석은 항상 문제가되었습니다,.이 약 5,000 다른 세포 유형을 가진 포유류의 뇌에 특히 사실이다 전에 레이저 캡처 microdissection (LCM) 기술, 외상성 뇌 손상의 효과 게놈 연구의 발전 4 생체에서 다른 neuronal 세포 유형의뿐만 아니라 glial 및 immunomodulatory 세포를 지원뿐만 아니라 구성 뇌 세포의 혼합 인구의 유전자 발현 분석을 기반으로했다. 그 결과 복잡한 유전자 발현 프로파일이 이기종 조직에서 얻은, 그리고 부상을 유발 세포 신호의 자주 충돌 패턴은 외상성 뇌 손상 5.의 사전 임상 연구에서 효과가 입증 된 치료 전략의 인간 임상 실험에 실패에 대해 하나의 설명이 될 수 있습니다
쥐 엉덩이에서 뉴런의 위험에 노출 된 인구에 부상을 유발 유전자 표현의 명확한 이해를 구하려면pocampus, 우리가 처음 Emmert – 벅 외에 의해보고 LCM의 기술,. 3 그 후, 우리는 정량 실시간 PCR과 microarray 분석을 사용하여 뉴런과 mRNA 프로파일위한 단일 뉴런의 풍부한 인구를 효율적으로 캡처이 microdissection 기술을 수정 및 최적화를 채택 . 게놈 분석을위한 뇌 조직의 냉동 섹션에서 mRNA의 무결성을 유지하기 위해, 우리는 고정, 염색 및 냉동 쥐 뇌 섹션에서 뉴런의 빠른 캡쳐를위한 기존의 프로토콜을 수정했습니다. 식별 및 부상자와 죽어 hippocampal 뉴런의 격리를 들어, 우리는 또한 LCM에 대한 플루오로 – 제이드의 착색 기술을 최적화. 플루오로 – 샤오 뤼는 apoptotic 및 괴사 세포 죽음을 구분하지 않습니다. 따라서, degenerating의 뉴런의 모든 종류의이 얼룩. 6,7에 의해 감지 할 수 있습니다
여기, 우리는 하나의 죽어 또는 생존 뉴런의 수영장뿐만 아니라 강화 populati의 swaths를 얻기 위해 우리 실험실에서 사용되는 프로토콜을 설명서로 다른 neuronal 세포 유형 (외상성 뇌 손상 후 유전자 발현 분석을위한 예 CA1-CA3 뉴런)의 기능. 저희 연구실에서 수행 유체 타악 뇌 손상에 대한 절차는 Shimamura 외., 8에 자세히 설명하고 앨더 외에 의해 목성에 출판 된 마우스의 측위 유체 – 타진 부상 프로토콜과 매우 유사 수 있습니다. 9 LCM 기술이 있기 때문에 DNA의 무결성에 최소한의 또는 전혀 효과가 표시되어, RNA와 조직에 단백질,이 정의 세포 유형의 분자와 단백질 분석을위한 훌륭한 도구입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 LCM 기술은 외상성 뇌 손상의 분자 메커니즘을 이해하는 중요한 발전을 할 수있게되었습니다. 8,10,11,12,13 우리는 쥐 해마의 독특한 하위 지역은 유전자 발현 프로파일을 가지고 있다는 것을 입증하는이 기술을 활용하는 최초의 조사로 말입니다 부상의 선택적 보안 취약점과 상관 관계. 우리의 연구는 우리가 아니라 몇 십 등의 레이저 캡처 세포에서 qPCR에 의해 유전자 발현을 수량화하고 600 촬영 셀처럼 몇의 게놈 전체의 microarray 분석을 수행 할 수 있다는 수 있다는 보여 주었다. LCM은 다양한 신경과 neuropsychiatric 장애에 연루 것으로 알려져있는 다른 뇌 영역의 유사한 연구에 귀중한 도구가 될 것입니다. 예를 들어, LCM을 사용하여 연구들에 연루 보상 회로에 관여하는 핵 accumbens의 게놈 전체의 프로파일 연구를 substantia nigra, 14 도파민 뉴런에서 파킨슨 병의 pathogenesis에 빛을 버리고 왔으며ubstance 남용 장애. 15
Neuronal 이질성은 게놈 수준 16에서 반영되어 있으며 임상 실험에서 외상성 뇌 손상에 대한 실험 치료의 성공의 부족에 참여할 수 있습니다. 따라서, 우리의 목표는 외상성 뇌 손상 후 neuronal 생존에 영향을 미치는 중요한 요소를 조사하기 위해이 기술을 활용하는 것입니다. 죽음과 인접 외상성 뇌 손상 후 hippocampal 뉴런을 생존의 최근 게놈 전체의 프로파일 연구는 세포 죽음의 유전자에 세포 생존의 표현 수준의 비율을 반영하는 휴대 가감 저항기는 외상성 뇌 손상 후 세포의 운명을 조절하는 것이 좋습니다. 이러한 지속적인 연구 적극적으로 세포 생존 가감 저항기에 영향을 미칠 수 pharmacotherapeutic 전략의 설계 및 개발에 기여하는 것입니다. 또한, 현재 외상성 뇌 손상 후 hippocampal 뉴런의 잠재적 인 치료 약물 치료의 효과를 추적하고 모니터링 할 수 LCM 사용합니다. 따라서, 우리의 연구는 주어진주의 RNase 무료 처리 기술과 일부를 보여기존 프로토콜의 수정, 그건 정확한 정량 유전자 발현 분석을위한 LCM에서 고품질의 RNA 샘플을 얻을 수 있습니다.
그러나 LCM 기술과 관련된 몇 가지 함정이 있습니다. 예를 들어, microglia 오염없이 만 neuronal 세포를 수집하는 것은 거의 불가능 할 수 있습니다. 해마의 피라미드 세포 레이어에는, 세포의 95 %가 glial 및 다른 세포 유형의 작은 비율을 남겨두고 피라미드 세포와 10 %의 interneurons 될이 인구의 90 %를 뉴런. 8,17 것으로 추산되었습니다 우리의 연구에서 18 우리는 플루오로 – 비취 특히 뇌 조직 만 부상 뉴런에 이름표를 형광 염료를 사용합니다. GFAP에 대한 표시입니다 다른 얼룩이 microglia를 착색 할 필요가 것입니다. 만 플루오로 – 비취 스테인드 하나 neuronal 몸을 수집 19 뉴런의보다 동질적인 인구를 보장합니다. 문제 해결 필요할 수 있습니다 또 다른 일반적인 문제는 원이 더 있다는 것입니다 없음레이저가 발사 될 때 t는 정의. 이 문제가 발생하면 레이저 설정을 확인하고 필요에 따라 힘과 시간을 조정할 필요가 있습니다. 또한 캡이 조직에 평면 배치하고 팔에 제대로 장착되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다. LCM 기술 설명서를 참조하거나 기술 지원을 호출하는 것은 때때로 필요합니다. LCM 및 RNA 격리 후, RNA의 품질은 항상 이전의 유전자 발현 분석에 bioanalyzer을 사용하여 평가해야한다.
레이저 절단 (생명 기술, Leica 마이크로 시스템즈) 및 (Zeiss) 악기를 catapulting 레이저를 포함한 현재 시장에서 레이저 캡처 장비의 여러 종류가 있습니다. 우리 LCM 시스템은 세포의 작은 숫자를 캡처에 적합합니다. 기타 높은 처리량 및 더 많은 자동화 된 시스템은 게놈 특히 proteomic 분석을위한 세포의 큰 숫자를 얻기위한 더 적당 할 수 있습니다. 사실, 이러한 자동화 된 시스템을 사용하여 LCM은 PR의 분석을위한 큰 잠재력을 가지고식별 셀 또는 셀의 풍부한 인구의 otein 표현. 20 또한, LCM은 우리가 가장 이질적인 조직의 복잡성에 관계없이 정의 된 셀 유형의 유전자 발현을 조사 할 수 있도록 immunolabeled 세포, 21 유전자 발현 분석을 용이하게 할 수 있습니다. 따라서, LCM은 세포의 단일 또는 풍부한 인구의 첨단 분자 연구를위한 훌륭한 도구입니다.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 R01 NS052532 (HLH에), 무디스 재단, 그리고 마취과학과의 지원을 받고 있습니다. 우리는 로리 굵은 글꼴, 그들의 편집 지원 크리스틴 Courteau 집사와 크리스티 페리, 그리고 레이아웃 및 모든 그림, 테이블과 작품의 훌륭한 생산 크리스티 페리 감사드립니다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | |
| PixCell IIe Laser Capture Microscope | Life Technologies (Arcturus) | ||
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
| RNAqueous Micro- Kit | Life Technologies (Ambion) | AM1931 | |
| Agilent 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Capsure LCM caps | Applied Biosystems | LCM0211/LCM0214 | |
| Fluoro-Jade | Histo-chem Inc. | #1FJ | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma-aldrich | C5042-10G | |
| Xylene (Histological grade) | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
| Ethanol 200 proof (Histological grade) | UTMB pharmacy | ||
| RNase free barrier pipette tips | Fisher Scientific | 2123635, 212364, 212361, 21-236-2A | |
| Arcturus Laser Capture Microdissection system (Life Technologies) Zeiss Laser Microdissection The PALM family Leica Microsystems |
Riferimenti
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