Summary

マウスのパイエル板のリンパ球や樹状細胞を単離し、免疫染色

Published: March 17, 2013
doi:

Summary

パイエル板の細胞の特定の亜集団(PPS)、腸管関連リンパ組織の主要な誘導部位の免疫学的機能を理解する上で関心が高まっている。ここでは、フローサイトメトリー解析と免疫染色のためのPPの凍結切片のための単一細胞調製物を調製するためのPPのパラレルプロトコルの概要を説明します。

Abstract

パイエル板(PPS)は腸管関連リンパ組織(GALT)の不可欠な構成要素であり、腸の免疫監視と恒常性に中心的な役割を果たします。腸管腔における粒子状抗原や微生物を連続濾胞関連上皮にPP M細胞によってサンプリング(FAE)と樹状細胞(DC)、マクロファージ、リンパ球の基盤となるネットワークに輸送される。この記事では、我々は、マウスのPPは、(i)単一細胞懸濁物に解離され、フローサイトメトリーにかけ、(ii)の凍結セクショニングと免疫染色のために準備されているプロトコルについて説明します。フローサイトメトリーのために、PPは機械的に解離され、次に上皮細胞と大きな破片の自由な単一の細胞懸濁液を生成するために70μmの膜を通して濾過した。 20から25 PPS(4匹から)以降では、この度は迅速かつ再現性のある方法は、> 90%の細胞生存率> 2.5×10 6細胞集団が得られます。凍結セクショニングのため、新鮮なLY孤立PPはcryomicrotomeを使用して、最適切断温度(OCT)培地、液体窒素で瞬間凍結し、切片に浸漬される。組織切片(5-12μm)は、アセトンやメタノールで固定し、空気乾燥され、その後免疫標識を行った。

Introduction

パイエル板(PPS)は、ヒトおよびマウスの小腸( 図1)を全体に存在する組織化されたリンパ濾胞の巨視的凝集体であると粘膜免疫応答は食物抗原、共生細菌、病原微生物、及び経口ワクチンに対して開始されるときの主要な部位を構成1-4。このような腸間膜リンパ節など他の末梢リンパ組織とは異なり、PPは、輸入リンパ管を欠いている。このように、PPSに適応免疫応答は、腸管腔に由来する抗原に応答して駆動されています。管腔の抗原のサンプリングは、腸およびM細胞として知られている抗原のサンプリングセルの両方で構成されている濾胞関連上皮(FAE)によって達成される。 FAEの下に、サブ上皮ドーム(SED)の領域では、マクロファージ、B細胞、CD4 + T細胞は5月9日と混ざり樹状細胞(DC)のネットワークがあります。各PPリンパfolliclの中核にeは、濾胞樹状細胞(FDCS)とT細胞が豊富な濾胞ゾーンが隣接のB細胞が豊富な中央の胚中心である。のIgA + B細胞plasmablastsとCD4 +エフェクターとメモリセルの開発にPPSの結果による抗原サンプリングその種子周囲の粘膜固有層および粘膜侵略に広い範囲への耐性を提供します。

PPSの抗原サンプリング、処理、プレゼンテーションに関連する複雑な免疫学的事象を解剖すると、PP細胞が腸管粘膜における総リンパ球様細胞のごく一部を構成することを考えると、大変な作業です。この環境における細胞 in vitro の特性評価支援するために、我々は、フローサイトメトリーおよび機能解析だけでなく、免疫蛍光顕微鏡および免疫組織学のための凍結切片を調製するためのPPのプロトコルのために全マウスのPP細胞を調製するためのプロトコルを提供する。覚書の分離、特性評価、および免疫染色のために、我々のプロトコル電子PPの細胞は、これらの技術を5,6,9-11を引用 、25年以上さかのぼる多くの参照があるという事実によって証明されるように、 それ自体は小説ではありません。むしろ、我々のプロトコルは、初めてPPを集める研究者のための合理化された(とビジュアル)メソッドを提供します。私たちが説明する技術を容易に習得し、容易に> 90%の細胞の生存率を持つ細胞を大量に産出されています。凍結セクショニングプロトコルは、理想的には、免疫蛍光染色し、共焦点イメージングに適した再現性の高い連続切片が得られます。さらに、我々のプロトコルは、2つの他の最近のJoveの記事補完します。最初は、福田らは、12のPP M細胞による病原細菌の取り込みを評価するためにライゲート回腸ループアッセイの使用について説明します。もう一つは、Geemらによる、マウスの腸粘膜からの樹状細胞やマクロファージの単離および特性を説明していますが、明示的に分析13からPPを除外。

Protocol

動物は、従来、特定の病原体を含まない条件下で飼育し、ワズワースセンターの機関動物実験委員会(動物実験委員会)のガイドラインに完全に準拠して処理した。 1。経口胃管栄養法 22 G 1.5倍インを使用して、目的の抗原や微生物との選択(任意)強制経口マウス系統。平滑末端給餌針(Popperの科学、ニューハイドパーク、ニューヨーク州)。配達ボリューム?…

Representative Results

合計PP細胞の単分散懸濁液を用いたフローサイトメトリー解析は良いと貧しい細胞調製の間に明確な区別を明らかにする。 80%以上の生存率との良好な細胞調製では、細胞の大半は高い前方散乱(FSC)、高細胞容積の指標、および低側方散乱(SSC)が、低い細胞粒度( 図2A)のインジケータを示しています。この実験では、我々はまた、意図的に(代わりPHEMのPBSプラス1%FCSを含?…

Discussion

この記事では、我々は免疫染色、フローサイトメトリーおよび機能解析および凍結切片のための単一細胞調製物を調製するためのPPのパラレルプロトコルを提供してきました。どちらの方法でも、フローサイトメーターとクライオスタットが利用可能である限り、再現性の高い、容易にアクセス可能です。初めての調査官のためには、脾臓と比較すると、PPSからの全細胞収量が比較的貧弱で?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我々は、パラフィン切片を調製するための細胞分析とヘレン·ジョンソン(ワズワースセンター動物組織病理コア)を支援するためのRenjie·ソング(ウォッズワースセンターのフローサイトメトリーコア)に感謝。我々は、共焦点顕微鏡と画像収集の支援については博士リチャードA·コール(ウォッズワースセンター光顕微鏡コア)に感謝。我々は、アニメーションの支援についてはアンディベントレー(ウォッズワースセンターの写真とイラスト)承認したいと思います。

MDJは、ライフサイエンス研究財団、ハワードヒューズ医学研究所(HHMI)フェローシップでサポートされています。 SAはワズワースセンター·ヘルスリサーチ株式会社学内ポスドクでサポートされています。この作品は、NIHの助成HD061916とGM082978によって部分的にサポートされていました。

Materials

Item Company Cat. # Comments (optional)
OCT Compound Tissue-Tek 4583
7x7x5 mm Base Molds Fisherbrand 22-363-552
ImmEdge Pen Vector Labs H-4000
Superfrost Plus Slides Thermo Scientific 4951
Edge Rite Blade Thermo Scientific 4280L
Anti-Mouse CD11c-PE eBioscience 17-0114-82
Anti-Mouse CD45R/B220-APC BD Pharmigen 553092
Anti-Mouse CD3-FITC BD Pharmigen 561798
Anti-Mouse CD4-PE BD Pharmigen 553652
Anti- Mouse CD8-PE BD Pharmigen 553032
Anti-Mouse CD19-PercP BioLegend 115531
Hank’s balanced salt solution (HBSS) without phenol red Fisher Scientific 14175-079
70 μm cell strainer BD Falcon 352350
Spleen Dissociation Medium Stem Cell Technologies 7915
Goat serum Invitrogen 16210-072
Fc Block ATCC 2.4.G2 HB-197 Supes obtained from cell line 2.4.G2
Curved Scissor F.S.T 14061-09
Cryostat Leica 3050S
FACS Calibur BD
Countess Cell Counter Invitrogen
Hematoxylin Richard Allan 7211
Eosin Richard Allan 71304
Formalin Starplex Scientific 3661

Table 1. Reagents and equipment used in this study.

Riferimenti

  1. Mantis, N. J., Rol, N., Corthesy, B. Secretory IgA’s complex roles in immunity and mucosal homeostasis in the gut. Mucosal. Immunol. 4, 603-611 (2011).
  2. Neutra, M., Mantis, N., Kraehenbuhl, J. P. Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissue. Nature Immunology. 2, 1004-1009 (2001).
  3. Rescigno, M., Sabatino, A. D. i. Dendritic cells in intestinal homeostasis and disease. J. Clin. Invest. 119, 2441-2450 (2009).
  4. Suzuki, K., Kawamoto, S., Maruya, M., Fagarasan, S. GALT: organization and dynamics leading to IgA synthesis. Adv. Immunol. 107, 153-185 (2010).
  5. Iwasaki, A., Kelsall, B. L. Localization of distinct Peyer’s patch dendritic cell subsets and their recruitment by chemokines macrophage inflammatory protein (MIP)-3alpha, MIP-3beta, and secondary lymphoid organ chemokine. Journal of Experimental Medicine. 191, 1381-1394 (2000).
  6. Iwasaki, A. Mucosal dendritic cells. Annu. Rev. Immunol. 25, 381-418 (2007).
  7. Lelouard, H., Fallet, M., de Bovis, B., Meresse, S., Gorvel, J. P. Peyer’s Patch Dendritic Cells Sample Antigens by Extending Dendrites Through M Cell-Specific Transcellular Pores. Gastroenterology. 42, 592-601 (2011).
  8. Lelouard, H., et al. Pathogenic bacteria and dead cells are internalized by a unique subset of Peyer’s patch dendritic cells that express lysozyme. Gastroenterology. 138, 173-184 (2010).
  9. Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer’s patches. Infect. Immun. 71, 504-509 (2003).
  10. Favre, L., Spertini, F., Corthesy, B. Secretory IgA possesses intrinsic modulatory properties stimulating mucosal and systemic immune responses. J. Immunol. 175, 2793-2800 (2005).
  11. Kelsall, B. L., Strober, W. Distinct populations of dendritic cells are present in the subepithelial dome and T cell regions of the murine Peyer’s patch. J. Exp. Med. 183, 237-247 (1996).
  12. Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer’s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. J. Vis. Exp. (58), e3225 (2011).
  13. Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine. J. Vis. Exp. (63), e4040 (2012).
  14. Lopez-Guerrero, D. V., et al. Rotavirus infection activates dendritic cells from Peyer’s patches in adult mice. J. Virol. 84, 1856-1866 (2010).

Play Video

Citazione di questo articolo
De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer’s Patches. J. Vis. Exp. (73), e50167, doi:10.3791/50167 (2013).

View Video