Summary

Isolare e Immunostaining linfociti e le cellule dendritiche da placche di Peyer murino di

Published: March 17, 2013
doi:

Summary

Vi è un crescente interesse per la comprensione delle funzioni immunologiche specifiche sottopopolazioni di cellule nelle placche di Peyer (PP), i siti primari induttivi di gut-tessuti linfoidi associati. Qui delineare protocolli paralleli per la preparazione di PP preparazioni di cellule singole per l'analisi di citometria a flusso e criosezioni PP per immunostaining.

Abstract

Placche di Peyer (PP) sono parte integrante dei tessuti linfoide associato all'intestino (GALT) e gioca un ruolo centrale nella immunosorveglianza intestinale e l'omeostasi. Antigeni particolato e microbi nel lume intestinale sono continuamente campionata da PP cellule M nel follicolo-associato epitelio (FAE) e trasportato a una rete sottostante di cellule dendritiche (DC), macrofagi e linfociti. In questo articolo, descriviamo protocolli in cui PPs murini sono (i) dissociato in sospensioni di cellule singole e sottoposti a citometria di flusso e (ii) preparato per criosezionamento e immunocolorazione. Per citometria di flusso, PP sono dissociate meccanicamente e poi filtrata attraverso membrane 70 micron per generare sospensioni di cellule singole libere delle cellule epiteliali e detriti grande. Partendo con 20-25 PP (da quattro topi), questo metodo veloce e riproducibile produce una popolazione di> 2,5 x 10 6 cellule con> vitalità cellulare del 90%. Per criosezionamento, frescoPP ly isolati sono immersi in ottimale temperatura di taglio (OCT) medio, snap-congelato in azoto liquido, e quindi sezionato con un cryomicrotome. Le sezioni di tessuto (5-12 micron) sono essiccati all'aria, fissato con acetone o metanolo, e quindi sottoposti a immunomarcatura.

Introduction

Placche di Peyer (PP) sono aggregati macroscopici organizzati follicoli linfoidi presenti in tutto l'intestino tenue di esseri umani e topi (Figura 1) e costituiscono i siti primari avviate mucosali risposte immunitarie contro antigeni alimentari, batteri commensali, patogeni microbici e vaccini orali 1-4. A differenza di altri tessuti linfoidi periferici, come i linfonodi mesenterici, PPs mancano vasi linfatici afferenti. Come tali, le risposte immunitarie in PP sono guidati in risposta ad antigeni derivati ​​dal lume intestinale. Il campionamento di antigeni luminali è compiuta la dal follicolo-associata epitelio (FAE), che consiste di due enterociti e antigene-campionamento cellule note come cellule M. Sotto la FAE, nel sub-epiteliale cupola (SED) regione, si trova una rete di cellule dendritiche (DC), mescolate con i macrofagi, cellule B e le cellule T CD4 + 5-9. Al centro di ogni follicl PP linfoidee sono cellule follicolari dendritiche (FDC) e una a cellule B ricco di centro in centro germinale, fiancheggiata da cellule T-zone ricche interfollicolari. Campionamento Antigen dai risultati PPs nello sviluppo di IgA + plasmablasts cellule B e le cellule effettrici CD4 + e la memoria che le sementi della lamina propria circostante e garantire l'immunità a una vasta gamma di invasori della mucosa.

Dissezione gli eventi immunologici complessi associati con il campionamento antigene, l'elaborazione e la presentazione in PP è un compito arduo, considerando che le cellule PP costituiscono solo una piccola frazione delle cellule linfoidi in totale mucosa intestinale. Per aiutare nella caratterizzazione in vitro di cellule in questo ambiente, forniamo un protocollo per la preparazione di cellule totali topo PP per analisi citofluorimetrica e funzionale, nonché un protocollo per la preparazione di PP criosezioni per immunofluorescenza e immunoistologia. Il nostro protocollo per l'isolamento, la caratterizzazione, e immunostaining di protocolli d'intesaposta cellule PP non è nuova di per sé, come dimostra il fatto che ci sono numerosi riferimenti risalgono a più di 25 anni che citano queste tecniche 5,6,9-11. Piuttosto, il nostro protocollo prevede una snella (e visivo) Metodo per investigatori raccolta PPs per la prima volta. Le tecniche che descrivono facilmente padronanza e prontamente produrre un gran numero di cellule con> la vitalità cellulare del 90%. Il protocollo criosezionamento produce sezioni seriali altamente riproducibili ideali per la colorazione e immunofluorescenza confocale. Inoltre, il nostro protocollo integra altri due articoli recenti Giove. Il primo, di Fukuda e colleghi, descrive l'uso di saggi ligato anello ileali per valutare la diffusione dei batteri patogeni da PP cellule M 12. L'altro, da Geem e colleghi, descrive l'isolamento e la caratterizzazione di cellule dendritiche e macrofagi dalla mucosa intestinale del mouse, ma esclude esplicitamente dalla loro analisi PP 13.

Protocol

Gli animali sono stati alloggiati sotto convenzionali, esenti da organismi patogeni specifici condizioni e sono stati trattati nel pieno rispetto Institutional Animal Care del Centro Wadsworth e uso Comitato (IACUC) le linee guida. 1. Sonda gastrica (Opzionale) topo ceppo Gavage di scelta con l'antigene o microbi di interesse utilizzando un 22 G x1.5-in. blunt-end ago alimentazione (Popper scientifico, New Hyde Park, NY). I volumi di consegna non deve superare i 400 microlitri…

Representative Results

Analisi citofluorimetrica di sospensioni monodisperse del totale delle cellule PP rivela una chiara distinzione tra preparazioni di cellule buone e poveri. In preparazioni di cellule buoni rapporti con oltre l'80% la redditività, la maggior parte delle cellule dimostrano alta forward scatter (FSC), un indicatore di volume cellulare alta, e disperdere lato basso (SSC), un indicatore di granularità delle cellule basso (Figura 2A). In questo esperimento, abbiamo anche volutamente preparato un "c…

Discussion

In questo articolo, abbiamo fornito protocolli paralleli per la preparazione di PP preparazioni di cellule singole per l'analisi di citometria a flusso e funzionale e criosezioni per immunostaining. Entrambi i metodi sono altamente riproducibili e facilmente accessibile, fornito un citofluorimetro e criostato sono disponibili. Per investigatori prima volta è opportuno sottolineare che, rispetto alla milza, produzioni di cellule totali di PP sono relativamente scarse. Tuttavia, il protocollo delineiamo generalmente …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo canzone Renjie (Wadsworth Nucleo Centro Citometria di flusso) per l'assistenza in analisi di cellule e Helen Johnson (Wadsworth Centro Animal Istopatologia Core) per la preparazione delle sezioni di paraffina. Ringraziamo il Dott. Richard A. Cole (Wadsworth Core Light Centro di microscopia) per l'assistenza con la microscopia confocale e raccolta di immagini. Vorremmo riconoscere Andy Bentley (Wadsworth Center Foto e Illustrazione) per l'assistenza con le animazioni.

MDJ è supportato dal Life Sciences Research Foundation, Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Fellowship. SA è supportato da un Centro di Salute-borsa Wadsworth Research Inc. intramurale post-dottorato. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni NIH HD061916 e GM082978.

Materials

Item Company Cat. # Comments (optional)
OCT Compound Tissue-Tek 4583
7x7x5 mm Base Molds Fisherbrand 22-363-552
ImmEdge Pen Vector Labs H-4000
Superfrost Plus Slides Thermo Scientific 4951
Edge Rite Blade Thermo Scientific 4280L
Anti-Mouse CD11c-PE eBioscience 17-0114-82
Anti-Mouse CD45R/B220-APC BD Pharmigen 553092
Anti-Mouse CD3-FITC BD Pharmigen 561798
Anti-Mouse CD4-PE BD Pharmigen 553652
Anti- Mouse CD8-PE BD Pharmigen 553032
Anti-Mouse CD19-PercP BioLegend 115531
Hank’s balanced salt solution (HBSS) without phenol red Fisher Scientific 14175-079
70 μm cell strainer BD Falcon 352350
Spleen Dissociation Medium Stem Cell Technologies 7915
Goat serum Invitrogen 16210-072
Fc Block ATCC 2.4.G2 HB-197 Supes obtained from cell line 2.4.G2
Curved Scissor F.S.T 14061-09
Cryostat Leica 3050S
FACS Calibur BD
Countess Cell Counter Invitrogen
Hematoxylin Richard Allan 7211
Eosin Richard Allan 71304
Formalin Starplex Scientific 3661

Table 1. Reagents and equipment used in this study.

Riferimenti

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  3. Rescigno, M., Sabatino, A. D. i. Dendritic cells in intestinal homeostasis and disease. J. Clin. Invest. 119, 2441-2450 (2009).
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Citazione di questo articolo
De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer’s Patches. J. Vis. Exp. (73), e50167, doi:10.3791/50167 (2013).

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