In vivo de dos fotones de imágenes de dependientes Experience-Los cambios moleculares en las neuronas corticales

Los procedimientos experimentales se describen a continuación fueron aprobados por el Instituto Nacional de la Atención Mental de Salud Animal y el empleo y estaban de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

1. Pre-operatorio Preparación

1. Limpie todas las herramientas en un esterilizador caliente cordón antes de la cirugía aséptica, limpie el sitio de la cirugía con un 70% de etanol, y poner paños limpios gota. Use guantes estériles. Se anestesia el animal recién preparada con 1,2% de solución de avertina, dado a 0,02 ml / g, intraperitonealmente. Alternativamente, anestesiar con gas isoflurano a través de un cono nasal, 5% para la inducción, 1,5% para el mantenimiento, con un circuito eliminador pasiva. Compruebe el nivel de anestesia con pizcas de cola o del pie para asegurarse de sedación total.
2. Cubrir los ojos del animal con ungüento oftálmico estéril, y se inyecta dexametasona recién preparada (0,2 mg / kg) y carprofeno (5 mg / kg) subcutaneously para prevenir la hinchazón y la inflamación cerebral ^11. Afeitar el pelo sobre el cráneo entre las orejas, y esterilizar la piel con matorrales betadine y tres hisopos alternos de 70% de etanol.
3. Montar el animal en una etapa de la cirugía estereotáxica con earbars, con una almohadilla de calentamiento de agua de circulación a continuación el conjunto de los animales a 37 ° C. Compruebe regularmente los niveles de anestesia del animal, así como complementar el original dosis de anestesia según sea necesario.
4. Inyectar 200 l de bupivacaína al 0,5% debajo de la piel del cuero cabelludo para adormecer el área. Incisión de la piel y eliminar el colgajo de piel sobre el cráneo. Retire el periostio y seque el área con hisopos de algodón limpios.

2. Cirugía crónica ventana craneal

1. Use un taladro dental de alta velocidad con una fresa de 0,5 mm para delinear suavemente un círculo 3-5 mm de diámetro en la región cerebral de interés. Periódicamente humedecer el sitio de perforación con polvo estéril al 0,9% de solución salina y hueso clara distancia con hisopos de algodón limpios. Si los sangrados de hueso, utilizar gelfoam remojados previamente con solución salina estéril para secar la hemorragia y esperar a que se detenga.
2. Cuando la capa de hueso se llega al último, levante y retire la isla hueso con unas pinzas de punta fina. Dura adjuntos a la plataforma inferior del hueso se pueden encontrar si la ventana cruza una sutura ósea. Éstos se deben retirar suavemente el colgajo óseo se levanta.
3. Rollo de espuma de gel humedecido suavemente sobre la duramadre expuesta a limpiar su superficie y esperar a que el sangrado dural dejar paso crítico:. No continúe hasta que la hemorragia se ha detenido dural. La sangre que queda atrapada en el interior de la ventana craneal usualmente lleva a una ventana opaca.
4. Si la región de interés está bajo un lugar donde la duramadre es particularmente gruesa, la eliminación de la duramadre por encima puede ser necesario. Si este es el caso, separar suavemente la dura desde la pia abajo con pinzas muy finas, realizar una pequeña incisión en la duramadre levantado con otro par de pinzas finas, a continuación, sujete los bordes de corte y suavementedividir la duramadre. La duramadre es delgada pero fuerte, así que ten cuidado de no cortar el cerebro con los bordes intactos de la duramadre.
5. Enjuague el área con ACSF estéril o solución salina estéril.
6. Coloque un cubreobjetos de vidrio estéril (3-5 mm) a lo largo de la duramadre o pia paso crítico:. Si las curvas del cráneo que rodean de manera significativa, el uso Kwiksil adhesivo ¹² para llenar los espacios donde la dura o pia no hacen contacto con el cubreobjetos en regiones que no se va a examinar.
7. El uso de gel de cianoacrilato para cubrir el adhesivo elastómero y los bordes del cubreobjetos de vidrio. Cubrir el cráneo expuesto con toda gel de cianoacrilato, o una mezcla de cemento y krazyglue dental paso crítico:. No permita que el gel de cianoacrilato para tocar la superficie del cerebro.
8. Insertar una medida cabeza de metal barra de sujeción en el extremo opuesto del cráneo.
9. Volver al animal a una cámara de recuperación caliente, después de una inyección intraperitoneal de ketoprofeno, 5 mg / kg, for el manejo del dolor. Continuar con el analgésico durante dos días más después de la operación.
10. Después de dos semanas de recuperación post-operatoria, anestesiar al animal con isoflurano (5% para la inducción, 1,5% para mantenimiento), montarlo en una platina del microscopio a medida con un marco de fijación de cabeza, y marque la ventana craneal para la claridad óptica bajo iluminación con luz azul. Superficie hematoencefálica claridad recipiente es altamente indicativo de la calidad de ventana craneal. Si los bordes de los vasos sanguíneos están claramente definidos, la ventana es probable que sea utilizable. El dos semanas después de la operación el tiempo de recuperación se recomienda para permitir tiempo suficiente para que el animal pueda recuperarse de la cirugía. Ventanas craneales típicamente limpiar y mejorar durante este tiempo, y siendo ópticamente transparente para semanas adicionales a mes hasta rebrote de cráneo o engrosamiento de la duramadre degrada la calidad de ventana.

3. Protocolo del comportamiento y de escaneo láser de dos fotones microscopía

1. Los animales con clara cventanas ranial estará expuesto a un estímulo ambiental o sometidos a una sesión de entrenamiento del comportamiento, y luego fotografiada después en el momento de máxima Arc-GFP expresión. Antes de iniciar un protocolo de comportamiento, el animal deberá ser mantenido en un entorno doméstico jaula consistente para minimizar día a día variación en los niveles basales de expresión de GFP-Arc.
2. Comenzar el entrenamiento conductual o paradigmas ambientales de estimulación, en función de la región cerebral de interés. Por ejemplo, los animales pueden ser expuestos a diferentes ambientes visuales en días consecutivos, y fotografiado cada día después de la estimulación visual para identificar específicos de estímulo-respuesta en la corteza visual ^10.
3. Arc-GFP fluorescencia en las neuronas normalmente alcanza su nivel máximo dos horas después de la estimulación. La línea de tiempo experimental puede ser optimizado para facilitar la detección de la expresión Arc-GFP en las neuronas en sus niveles pico de fluorescencia.
4. Después de una sesión de entrenamiento conductual o environmental estimulación se completa, anestesiar al animal con isoflurano (5% para la inducción, 1,5% para el mantenimiento) y montar el animal en la platina del microscopio a medida con bastidor de la cabeza de fijación bajo el microscopio de dos fotones.
5. La posición de la cabeza del animal se fija al bastidor de la cabeza de fijación que se conecta directamente a la etapa, con la barra de metal implantado en el cráneo. El isoflurano y oxígeno se suministran continuamente al ratón a través de un cono nasal. La temperatura corporal se mantiene utilizando una almohadilla térmica.
6. Asegúrese de que los detectores de microscopio están protegidos de la luz ambiente mediante la realización de dos fotones de láser de barrido en una habitación oscura. Utilice un objetivo de inmersión en agua 20x o 25x (1,05 apertura numérica) para formación de imágenes. En primer lugar, en virtud de epi-fluorescencia iluminación, adquirir una imagen de los patrones de los vasos sanguíneos superficiales más de la región del cerebro de interés con una cámara CCD para la alineación de la imagen en el futuro.
7. Iniciar la de dos fotones de exploración por láser para adquirir una pila de imágenes en 3-D. Una Olympus FV1000MPE multi-fotón microscopio se utiliza en nuestra configuración. La excitación de longitud de onda del láser de dos fotones se ha fijado en 920 nm, y la potencia del láser emitido desde el objetivo se fija a aproximadamente 50 mW. Fluorescencia emitida se detecta simultáneamente en los canales verde y rojo (espejo dicroico a 570 nm, filtros de barrera a 495-540 nm y 570-625 nm), utilizando un externo de dos canales sistema de detección photomutiplier colocado cerca de la muestra. Arc-GFP fluorescencia sólo aparece en el canal verde, mientras que el tejido auto-fluorescencia aparece tanto en los canales ^{13, 14.}
8. Pilas típicas imágenes tienen dimensiones de aproximadamente 320x320x100 m (largo x ancho x profundidad), una resolución horizontal de 0,5 m / pixel, y una resolución vertical de 3 m / pixel.
9. Después de adquirir la pila de imágenes, devolver el animal a su jaula. No moleste a los animales hasta la próxima sesión de imágenes y de comportamiento. Repita el comportamiento y el procedimiento de imagen a través de días como desired. Utilice la superficie previamente adquirido hematoencefálica imagen buque para orientar a la ubicación de imágenes iguales.

Este protocolo describe un método para rastrear dependientes experiencia-cambios moleculares en las neuronas corticales individuales en los animales vivos. Una ventana craneal crónica se crea por primera vez en una región cortical de interés en un ratón que lleva un indicador fluorescente de la expresión génica. Microscopía de dos fotones se puede acoplar con varios paradigmas de comportamiento para observar su comportamiento inducidos cambios moleculares en las neuronas individuales y rastrear tales cambios en los mismos conjuntos de neuronas a través de varios días (Figura 1).

En los ratones Arc-GFP, que dependen de experiencias cambios en la expresión génica puede Arc de forma fiable reflejado en las neuronas corticales individuales para varios días utilizando este protocolo. El transgénico Arc-GFP ratón knock-in expresa una proteína verde fluorescente desestabilizada (d2EGFP, proteínas de vida media de aproximadamente dos horas) bajo el control del promotor endógeno del gen temprano inmediato del arco (Figura 2).

Después de la recuperación de la cirugía ventana craneal, los animales están montados en una medida cabeza de fijación del bastidor y la etapa. Figura 3 representa la headbar y la cabeza de fijación del marco utilizado durante dos fotones de imágenes. El mantenimiento de un consistente de dos fotones imágenes de microscopio y la posición de fase de configuración facilitar el día a día realineación de imágenes al volver a una región del cerebro previamente formado la imagen, y aumentar la eficacia experimental cuando múltiples animales se exponen en el mismo día (Figura 4).

Durante el entrenamiento conductual o la estimulación ambiental, es aconsejablepara albergar animales individualmente, y en una ubicación de inicio jaula ambientalmente compatibles, para reducir al mínimo el día a día las fluctuaciones en los niveles de fondo de activación GFP Arc-(Figura 1).

Un signo importante de una ventana estable, craneal claro es el patrón nítido de los vasos sanguíneos bajo epi-fluorescente iluminación. Este patrón de vaso sanguíneo no debe cambiar significativamente a través de múltiples días de formación de imágenes (Figura 5).

La Figura 6 ilustra los patrones de expresión de Arc-GFP en las neuronas corticales frontales bajo una condición de línea de base jaula de alojamiento (A) y después de la actuación de un comportamiento motor nuevo (B). Capa II / III neuronas corticales en la misma región del cerebro en el mismo animal puede ser fiable reflejado, y las mismas neuronas deben ser capaces de ser identificados en varios días de formación de imágenes. Es típico para recoger una pila de imágenes en 3-D de cientos de muestras de neuronas. Bordes neurona debe ser fuerte y claro a lo largo del s imagentachuela. Tejido auto-fluorescencia en el canal rojo también proporciona un índice de claridad ventana. Si la región formado la imagen se vuelve más turbia drásticamente durante días, la calidad ventana craneal es probable deteriorado. Una ventana craneal típico seguirá siendo ópticamente transparente para al menos una semana. Después de varias semanas a meses, el nuevo crecimiento del cráneo de los bordes de la ventana craneal y engrosamiento de la duramadre eventualmente prevenir otros experimentos de formación de imágenes.

Figura 1. Un esquema delineando los pasos experimentales. Durante la fase de preparación de los animales, las cirugías craneales ventana se realizaron en ratones Arc-GFP. Los animales se dan alrededor de dos semanas para recuperarse de la cirugía en su jaula. La claridad de las ventanas craneal se comprueba utilizando microscopía de epi-fluorescencia. Si las ventanas están listos para la formación de imágenes, los animales son alojados individualmente en una zona tranquila, ambientalmente compatiblesentorno doméstico jaula, donde la fase de línea de tiempo experimental puede comenzar. El protocolo de estimulación del comportamiento y el intervalo de formación de imágenes puede ser adaptado para detectar Arc-GFP en su pico de fluorescencia, que se produce típicamente dos horas después de la activación. Después de la estimulación del comportamiento es completa, el animal se anestesia y la región cortical de interés se forma la imagen a través de la ventana craneal usando microscopía de dos fotones. El animal se devuelve entonces a la jaula de alojamiento. Las sesiones de comportamiento e imagen se puede repetir en día como se desee.

Figura 2. Un diagrama que ilustra la construcción del Arco-GFP de rebote en línea de ratón, en el que un gen que codifica la proteína verde fluorescente desestabilizada sustituye la parte de codificación del gen temprano inmediato del arco. En esta cepa de ratón, la expresión de GFP se encuentra bajo el control del promotor endógeno Arc. Este diagrama se dibuja de nuevo sobre la base dela descripción en la Referencia 10.

Figura 3. Esquema y las dimensiones de la configuración de la cabeza de fijación utilizado para la formación de imágenes de dos fotones. El medio sólido de la headbar está pegado a la parte posterior del cráneo (Sección 2,8), y el extremo con el orificio de tornillo se utiliza para unir la cabeza del animal anestesiado con el cuadro. El bastidor de la cabeza de fijación consiste en una chapa delgada de metal montada sobre dos postes con tornillos.

Figura 4. Ejemplo de un láser de barrido de dos fotones de configuración microscopio para obtener imágenes de Arc-GFP ratones. Tenga en cuenta el objetivo de inmersión en agua 25x, pista de calentamiento y platina del microscopio personalizado con un marco de fijación de cabeza. El anestesiados Arc-GFP ratón se muestra aquí está listo para imágenes in vivo.

Figura 5. Imágenes de los vasos sanguíneos del cerebro de superficie en una ventana craneal crónica durante varios días, mostrando la claridad y la estabilidad de los patrones de los vasos sanguíneos en el tiempo. Superficie del cerebro se ilumina con luz azul, y las imágenes fueron tomadas a través de una lente de 25x de inmersión en agua por una cámara CCD montada en el microscopio.

Figura 6. In vivo de dos fotones de imágenes de los patrones de expresión de GFP Arc-en las neuronas corticales frontales de un ratón después de dos experiencias diferentes de comportamiento. (A) El ratón se mantuvo en su jaula de alojamiento antes de formación de imágenes en el primer día. (B) El ratón realiza un comportamiento motor nuevo antes de formación de imágenes en el segundo día. Imágenes fluorescentes de la región cortical mismo se adquirieron simultáneamente en los canales verde y rojo. GFP fluorescencia sólo apareció en el canal verde, mientras que la autofluorescencia del tejido apareció en ambos canales. Detection parámetros se configura de manera que el tejido de fluorescencia auto-niveles en los canales rojo y verde tenían lecturas iguales, y estos parámetros se mantuvieron a lo largo de los experimentos. La señal del canal rojo se resta luego de la señal del canal verde para eliminar de banda ancha autofluorescencia del tejido durante el análisis fuera de línea. Las señales resultantes fluorescente verde de un 18 m de espesor 3-D pila de imágenes fueron proyectadas por la intensidad máxima al plano horizontal, para proporcionar una vista de arriba hacia abajo de los patrones celulares de expresión Arc-GFP. Barra de escala, a 30 m.

El método de obtención de imágenes in vivo descrito aquí permite el examen repetido de los cambios de expresión génica en Arco los mismos conjuntos de neuronas durante varios días en el animal vivo. Es un método eficiente y versátil para obtener información acerca de la plasticidad neuronal relacionada-dinámica molecular en neuronas individuales en respuesta a diversas experiencias de comportamiento. Estándar métodos histoquímicos tales como la hibridación in situ y la inmunotinción se puede lograr de una sola célula de resolución ^3, pero carecen de la capacidad de seguimiento de los cambios de expresión génica en las mismas neuronas durante múltiples días. Métodos de bioluminiscencia, resonancia magnética, nuclear o de imagen pueden seguir los cambios de expresión génica en el mismo animal a través de la prensa correspondientes ^15, pero carecen de la resolución espacial para distinguir los niveles de expresión en las neuronas individuales. Como tal, no hay otros métodos existentes para medir los cambios de expresión génica hacer coincidir la resolución espacial y temporal de la coberturatura del método de formación de imágenes se describe aquí.

Un paso crítico en este procedimiento es la cirugía ventana craneal. Se debe realizarse con mucho cuidado para evitar el trauma en el cerebro o la sangre que sale de debajo de la cubreobjetos de vidrio, lo que hará que la inflamación y reducen la claridad de ventanas craneales. Para bien realizados cirugías craneales, la ventana permanecerá transparente durante varias semanas hasta que el engrosamiento de la duramadre o recrecimiento del cráneo desde los bordes de la ventana evitar imágenes más. La duramadre se puede eliminar si es necesario, como se ha hecho para la formación de imágenes ópticas crónicas experimentos en ratas y monos ^16,17, para aumentar la claridad óptica de las ventanas craneales.

Una limitación de la técnica de microscopía de dos fotones utilizado en este protocolo es la profundidad de imagen. La profundidad de imagen máxima a la que imágenes de alta calidad se puede conseguir dependerá de la claridad ventana craneal, la configuración de microscopio, y el brillo de la fluoresc periodistas ENT. Para GFP ratones Arc-, por lo general la imagen de hasta 300 m por debajo de la superficie pial. Para examinar los cambios de expresión génica en regiones profundas del cerebro, la fluorescencia microendoscopy se puede aplicar para superar la limitación en la profundidad convencional de dos fotones microscopía ^18.

Los posibles factores de confusión para los cambios de expresión génica en determinadas con este método de imagen in vivo incluyen los efectos persistentes de la cirugía craneal o anestesia que pueden interferir con el rendimiento de comportamiento o la inducción de Arc-GFP. Es importante comprobar el alcance general de la activación Arc-GFP en respuesta a las experiencias específicas en el cerebro secciones fijas primero, y compararlo con el grado observado por imágenes de repetirse utilizando in vivo de dos fotones microscopía. El período de recuperación post-operatorio y los intervalos de formación de imágenes repetidas puede entonces ser ajustada para minimizar los efectos secundarios potenciales de la cirugía y la anestesia sobre la activación Arc-GFP.