Vivo em dois fótons de imagem de experiência dependentes de alterações moleculares em neurônios corticais

Os procedimentos experimentais descritos abaixo foram aprovados pelo Instituto Nacional de Atenção à Saúde Mental Animal e Comitê de Uso e estavam de acordo com o National Institutes of Health Guide para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

1. Preparação pré-operatória

1. Limpe todas as ferramentas em um esterilizador quente talão antes da cirurgia asséptica, limpar o local da cirurgia com etanol 70%, e colocou panos limpos. Usar luvas estéreis. Anestesiar os animais com uma solução preparada de fresco avertina a 1,2%, determinado a 0,02 ml / g, por via intraperitoneal. Alternativamente, anestesiar com gás isofluorano por meio de um cone de nariz, 5% para indução, 1,5% para a manutenção, com um circuito eliminador passiva. Verifique o nível de anestesia com pitadas cauda ou dedo do pé para garantir sedação plena.
2. Cobrir os olhos do animal com pomada oftálmica estéril, e injectar a dexametasona preparado de fresco (0,2 mg / kg) e carprofeno (5 mg / kg) subcutaneously para evitar inchaço e inflamação do cérebro ^11. Raspar o cabelo sobre o crânio entre as orelhas, e esterilizar a pele com esfoliação betadine e três compressas alternadas de etanol 70%.
3. Montar o animal num estágio cirurgia estereotáxica com earbars, com uma almofada de aquecimento de água de circulação abaixo do conjunto de animais, a 37 ° C. Verifique regularmente os níveis do animal de anestesia, e complementar a dose do anestésico original conforme necessário.
4. Injectar 200 ul de Marcaine 0,5% sob a pele do couro cabeludo para anestesiar a área. Faça uma incisão na pele e remover a retalho de pele sobre o crânio. Retire o periósteo e secar a área com compressas de algodão limpo.

2. Cirurgia Janela crônica craniana

1. Use uma broca de alta velocidade dental com 0,5 milímetros de rebarbas suavemente para delinear um círculo de diâmetro 3-5 mm sobre a região do cérebro de interesse. Periodicamente molhar o local de perfuração com pó de osso estéril 0,9% e limpar com cotonetes limpos. Se os sangramentos ósseas, use gelfoam previamente embebidos com solução salina estéril para apagar o sangramento e esperar por ele para parar.
2. Quando a camada último osso é atingido, levantar e remover a ilha osso com uma pinça de ponta fina. Dura anexos à prateleira inferior do osso pode ser encontrado se a janela atravessa uma sutura óssea. Estes devem ser cuidadosamente removidos como a aba de osso é levantado.
3. Rolo de espuma umedecido gel suavemente sobre a dura exposta para limpar a sua superfície e esperar por qualquer sangramento dural parar passo crítico:. Não prossiga até que todo sangramento dural parou. Sangue que fica preso dentro da janela craniano geralmente leva a uma janela opaca.
4. Se a região de interesse é em um local em que a dura-máter é particularmente espessa, a remoção da dura-máter acima, pode ser necessário. Se este for o caso, separar o suavemente dura a partir do pia abaixo com uma pinça muito finas, fazer uma pequena incisão na dura levantada com outro par de fórceps finos, então agarrar as extremidades cortadas e suavementedividir a dura-máter. A duração é fina, mas forte, por isso tome cuidado para não cortar o cérebro com as bordas intactas da dura.
5. Lavar a área com ACSF estéril ou soro fisiológico estéril.
6. Coloque uma lamela de vidro esterilizada (3-5 mm) sobre a dura-máter ou pia passo crítico:. Se as curvas em torno do crânio significativamente, usar Kwiksil adesivo ¹² para encher os espaços em que a dura-máter ou pia não fazem contacto estreito com a lamela em regiões que não vai ser trabalhada.
7. Use gel de cianoacrilato para cobrir o adesivo elastómero e as bordas da lamela de vidro. Cobrir todo o crânio exposta com gel de cianoacrilato, ou uma mistura de cimento e krazyglue dental passo crítico:. Não permitir que qualquer gel de cianoacrilato de tocar a superfície do cérebro.
8. Incorporar uma custom-made barra de metal de fixação da cabeça do lado oposto do crânio.
9. Reexpedição para uma câmara de recuperação quente, depois de uma injecção intraperitoneal de cetoprofeno, 5 mg / kg, for gestão da dor. Continuar o analgésico por mais dois dias de pós-operatório.
10. Após duas semanas de recuperação pós-operatória, anestesiar o animal com isoflurano (5% para indução, de 1,5% para manutenção), montá-lo em um estágio do microscópio custom-made com um quadro de cabeça de fixação, e verificar a janela craniana para claridade óptica sob iluminação com luz azul. Cérebro superfície clareza vaso sanguíneo é altamente indicativo de qualidade janela craniano. Se as extremidades dos vasos sanguíneos são bem definidas, a janela é susceptível de ser utilizável. A duas semanas de tempo de recuperação pós-operatório é recomendado para permitir tempo suficiente para que o animal a recuperar da cirurgia. Janelas cranianas tipicamente limpar e melhorar durante este tempo, e permanecem opticamente transparentes por semanas adicionais para meses até rebrota de crânio ou espessamento da dura degrada a qualidade da janela.

3. Protocolo de comportamento e de varredura a laser de dois fótons Microscopia

1. Animais com c clarajanelas ranial serão expostos a um estímulo ambiental ou submetidos a uma sessão de treino comportamental, e, em seguida, depois trabalhada no momento de expressão da GFP Arc-maximal. Antes de iniciar um protocolo de comportamento, o animal deve ser mantido num ambiente doméstico consistente gaiola para minimizar dia-a-dia da variação dos níveis de linha de base do arco GFP-expressão.
2. Começar a formação comportamental ou paradigmas de estimulação ambientais, dependendo da região do cérebro de interesse. Por exemplo, animais podem ser expostos a diferentes ambientes visuais em dias consecutivos, e visualizados por dia após a estimulação visual para identificar estímulo respostas específicas do córtex visual ^10.
3. Arc-GFP em neurónios fluorescência tipicamente atinge o seu nível máximo de duas horas após a estimulação. A linha do tempo experimental pode ser otimizada para facilitar a detecção de Arco GFP-expressão em neurônios em seus níveis máximos de fluorescência.
4. Depois de uma sessão de formação comportamental ou environmental estimulação é completado, anestesiar os animais com isoflurano (5% para indução, de 1,5% para manutenção) e montar o animal na platina do microscópio sob medida com a cabeça de fixação do quadro sob o microscópio de dois fotões.
5. A posição da cabeça do animal é fixado à armação da cabeça de fixação, que liga directamente à fase, utilizando-se a barra de metal implantados no crânio. Isoflurano e oxigénio são continuamente fornecidos ao rato através de um cone de nariz. A temperatura do corpo é mantida através de uma almofada de aquecimento.
6. Certifique-se que os detectores de microscópio são protegidos da luz ambiente através da realização de dois fótons de varredura a laser em um quarto escuro. Use uma lente de imersão de 20x ou 25x (1,05 abertura numérica) de água para geração de imagens. Primeiro, sob epi-fluorescência iluminação, adquirir uma imagem da superfície padrões dos vasos sanguíneos mais a região do cérebro de interesse com uma câmera CCD para o alinhamento da imagem futuro.
7. Comece dois fótons de varredura a laser para adquirir uma pilha de imagens 3-D. Um FV1000 OlympusMPE microscópio multi-fotão é usado em nossa configuração. A excitação comprimento de onda do laser de dois fotões está fixado em 920 nm, e a potência do laser emitido da objectiva é de cerca de 50 mW. Fluorescência emitida é detectada simultaneamente nos canais de verde e vermelho espelho dicróico (a 570 nm, filtro de barreira de 495-540 nm e 570-625 nm), usando um externo de dois canais do sistema de detecção photomutiplier colocados próximo do espécime. Arco-GFP fluorescência só aparece no canal verde, enquanto que o tecido auto-fluorescência aparece em ambos os canais ^{13, 14.}
8. Pilhas de imagens típicas têm dimensões de cerca de 320x320x100 ^ m (comprimento x largura x profundidade), uma resolução horizontal de 0,5 m / pixel e uma resolução vertical de 3 mm / pixel.
9. Depois de adquirir a pilha de imagens, o animal regressar à sua gaiola. Não perturbe o animal até a próxima comportamental e sessão de imagem. Repita o comportamento e procedimento de imagem em dia como desejáveled. Use o cérebro adquiridos anteriormente superfície da imagem vaso sanguíneo para orientar volta para o local de imagem mesmo.

Este protocolo descreve um método para rastrear experiência dependentes de alterações moleculares nos neurônios corticais individuais em animais vivos. Uma janela crónica craniana é primeiro criado sobre uma região cortical de interesse num rato carregando um repórter fluorescente da expressão do gene. Dois fotão-microscopia pode então ser acoplado com vários paradigmas de comportamento para observar comportamentalmente induzidas alterações moleculares em neurónios individuais e rastrear tais mudanças nos mesmos conjuntos de neurónios durante vários dias (Figura 1).

Em Arc GFP-ratos, experiência dependentes de mudanças na expressão gênica Arc podem ser confiavelmente fotografada em individuais neurônios corticais de vários dias usando esse protocolo. A knock-in Arc GFP-rato transgénico expressa uma proteína fluorescente verde desestabilizado (d2EGFP, a meia-vida da proteína de aproximadamente duas horas), sob o controlo do promotor endógeno do gene precoce imediato do arco (Figura 2).

Após a recuperação da cirurgia craniana janela, os animais são montados em uma custom-made quadro cabeça de fixação e palco. Figura 3 mostra a headbar e cabeça de fixação de quadro usado durante dois fótons de imagem. A manutenção de uma consistente de dois fotões microscópio de imagem e posição fase de instalação irá facilitar o dia-a-dia realinhamento das imagens, quando regressa a uma região do cérebro anterior com imagens, e aumentar a eficiência experimental, quando os animais são gravadas múltiplas no mesmo dia (Figura 4).

Durante o treinamento comportamental ou estimulação ambiental, é aconselhávelde animais domésticos, isoladamente, e em uma localização ambientalmente compatível casa gaiola, para minimizar o dia-a-dia de flutuações nos níveis de fundo Arc-GFP de activação (Figura 1).

Um sinal de crítica de um estábulo, janela transparente craniana é o padrão nítido dos vasos sanguíneos sob epi-fluorescente iluminação. Este padrão de vasos sanguíneos não deve alterar significativamente entre vários dias de imagiologia (Figura 5).

A Figura 6 ilustra os padrões de expressão de GFP-Arc em neurónios corticais frontais sob uma condição de linha de base da gaiola de origem (A) e após a realização de um novo comportamento motor (B). Camada II / III neurónios corticais na mesma região do cérebro, no mesmo animal pode ser fiavelmente trabalhada, e os mesmos neurónios deve ser capaz de ser identificado ao longo de vários dias de criação de imagens. É típico para recolher uma pilha de imagens 3-D de centenas de amostras de neurónios. Extremidades de neurônios deve ser nítida e clara em toda a imagem saderência. Tecido auto-fluorescência no canal vermelho também fornece um índice de clareza janela. Se a região de imagem torna-se mais sombria drasticamente ao longo de dias, a qualidade janela craniana é provável que se deteriorou. Uma janela típica craniano permanece opticamente clara para pelo menos uma semana. Depois de várias semanas a meses, o novo crescimento do crânio a partir das bordas da janela craniana e espessamento da dura-máter, eventualmente, evitar as experiências de imagiologia adicionais.

Figura 1. Um esquema delineando os passos experimentais. Durante a fase de Preparação Animal, cirurgias cranianas janela são executadas em Arc-GFP ratos. Os animais recebem cerca de duas semanas para se recuperar da cirurgia em sua gaiola. A claridade das janelas craniana é então verificada usando epi-fluorescência microscopia. Se as janelas estão prontos para a imagem latente, os animais são alojados individualmente em um silêncio, ambientalmente consistenteambiente familiar gaiola, onde a fase experimental Timeline pode começar. O protocolo de estimulação do comportamento e do intervalo de imagens pode ser adaptado para detectar Arc-GFP no seu pico de fluorescência, o que normalmente ocorre de duas horas após a activação. Após a estimulação do comportamento está completa, o animal é anestesiado e na região cortical de interesse é trabalhada por meio da janela craniana usando microscopia de dois fotões. O animal é então devolvido para a gaiola. As sessões de comportamento e de imagem pode ser repetido através de dias, conforme desejado.

Figura 2. Um diagrama que ilustra a construção do Arco-knock-GFP em linha do rato, em que um gene que codifica a proteína verde fluorescente desestabilizado substituído na parte codificante do gene precoce imediato do arco. Nesta estirpe de rato, a expressão da GFP está sob o controle do promotor Arco endógena. Este diagrama é redesenhada baseadoa descrição de Referência 10.

Figura 3. Esquemática e dimensões da configuração cabeça-fixação utilizado para imagiologia de dois fotões. A semi-sólida do headbar é colada à parte posterior do crânio (secção 2.8), e a extremidade com o orifício do parafuso é utilizado para fixar a cabeça do animal anestesiado para a armação. A armação de cabeça de fixação, constituído por uma placa fina de metal, montado sobre dois pólos, com parafusos.

Figura 4. Exemplo de uma varredura a laser de dois fótons de configuração do microscópio para Arc GFP-imagem ratos. Note-se a lente de imersão 25x água, almofada de aquecimento e do microscópio personalizado com um quadro cabeça de fixação. O rato Arc GFP-anestesiados mostrada aqui está pronto para imagem in vivo.

Figura 5. Imagens de vasos sanguíneos cerebrais de superfície de uma janela craniana crónica durante vários dias, demonstrando a clareza e estabilidade dos padrões dos vasos sanguíneos ao longo do tempo. Superfície do cérebro foi iluminada com luz azul, e as imagens foram obtidas por meio de uma lente de 25x de imersão em água por uma câmara CCD montada no microscópio.

Figura 6. In vivo de dois fótons imagens de padrões de boas práticas agrícolas Arco-expressão em neurônios corticais frontais de um rato após dois diferentes experiências comportamentais. (A) O rato permaneceu na sua gaiola de origem antes de imagem, no primeiro dia. (B) O rato realizado um comportamento motor novo antes de imagem no segundo dia. Imagens fluorescentes da mesma região cortical foram simultaneamente adquiridas nos canais de verde e vermelho. Fluorescência da GFP só apareceu no canal verde, enquanto autofluorescência de tecidos apareceu em ambos os canais. Detectioparâmetros n foram definidos de modo que o tecido auto-fluorescência níveis em ambos os canais vermelho e verde teve leituras iguais, e esses parâmetros foram mantidos ao longo experiências. O sinal do canal de vermelho foi então subtraído a partir do sinal do canal verde para remover a banda larga de tecido durante a autofluorescência análise off-line. Os verdes resultantes sinais fluorescentes a partir de uma 18 mm de espessura 3-D pilha de imagens foram projetadas pela intensidade máxima ao plano horizontal, para fornecer uma visão de cima para baixo dos padrões de celulares do Arco GFP-expressão. Barra de escala, 30 mm.

O método de imagem in vivo descrito aqui permite o exame repetido de mudanças Arco de expressão de genes nos mesmos conjuntos de neurônios durante vários dias no animal vivo. É um método eficiente e versátil para a obtenção de informação sobre a plasticidade neural relacionadas com a dinâmica molecular em neurónios individuais em resposta a várias experiências comportamentais. Padrão métodos histoquímicos como a hibridização in situ e imuno pode conseguir uma única célula resolução ^3, mas não têm a capacidade para controlar as alterações de expressão gênica em os mesmos neurônios durante vários dias. Métodos de imagem de bioluminescência, ressonância magnética, ou nuclear pode controlar as alterações de expressão de genes no mesmo animal através de repórteres apropriados ^15, mas falta a resolução espacial para distinguir os níveis de expressão em neurônios individuais. Como tal, não há outros métodos existentes para medir as mudanças de expressão gênica pode corresponder tanto a resolução espacial e temporal, a covdio do método de imagem descrito aqui.

Um passo fundamental neste processo é a cirurgia janela craniano. Deve ser efectuada com muito cuidado para evitar trauma para o cérebro ou no sangue deixando sob a lamela de vidro, o que irá provocar uma reacção inflamatória e reduzir a claridade de janelas cranianos. Para bem conduzidos cirurgias cranianas, a janela irá permanecer livre durante várias semanas até que o espessamento da dura-máter ou recrescimento do crânio a partir das bordas da janela de imagem evitar ainda mais. A dura-máter pode ser removida, se necessário, como tem sido feito para crónicas experimentos com imagens ópticas em ratos e macacos, ^16,17, para aumentar a clareza óptica das janelas cranianos.

Uma limitação para a técnica de microscopia de dois fótons utilizada neste protocolo é a profundidade de imagem. A profundidade máxima de imagem em que imagens de alta qualidade pode ser obtida dependerá da clareza janela craniana, a configuração do microscópio, e o brilho da fluoresc repórteres Ent. Para Arc GFP-ratos, que normalmente imagem em até 300 mm abaixo da superfície pial. Para examinar as alterações da expressão do gene em regiões profundas do cérebro, a fluorescência microendoscopy pode ser aplicado para ultrapassar a limitação de profundidade, em microscopia de dois fotões convencional ^18.

Potenciais fatores de confusão para as mudanças de expressão gênica determinado com este método de imagem in vivo incluem quaisquer efeitos remanescentes da cirurgia craniana ou anestesia que podem interferir com o desempenho comportamental ou a indução de Arco-GFP. É importante verificar a extensão total da Arc GFP-ativação em resposta a experiências específicas em seções cerebrais fixos primeiro, e comparar isso à medida observada por imagens repetidas in vivo utilizando dois fótons de microscopia. O período de recuperação pós-operatório e os intervalos repetidos de imagem pode então ser ajustada para minimizar os potenciais efeitos secundários da cirurgia e da anestesia sobre Arc GFP-activação.