In Vivo Imagerie biphotonique d'expérience qui dépendent des changements moléculaires dans les neurones corticaux

Les procédures expérimentales décrites ci-dessous ont été approuvés par l'Institut national de la santé mentale et des animaux comité sur l'utilisation et sont conformes aux National Institutes of Health Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire.

1. Préparation pré-opératoire

1. Nettoyer tous les outils dans un stérilisateur à billes à chaud avant la chirurgie aseptique, nettoyer le site de la chirurgie avec de l'éthanol à 70%, et posa toiles propres. Porter des gants stériles. Anesthésier l'animal avec une solution fraîchement préparée avertin 1,2%, donnée à 0,02 ml / g, intrapéritonéale. En variante, l'isoflurane avec du gaz anesthésier à travers un cône de nez, 5% pour l'induction, 1,5% pour la maintenance, avec un circuit accepteur passive. Vérifier le niveau d'anesthésie utilisant pincées de queue ou de l'orteil pour assurer une sédation complète.
2. Couvrir les yeux de l'animal avec une pommade ophtalmique stérile et injecter la dexaméthasone fraîchement préparée (0,2 mg / kg) et le carprofène (5 mg / kg) subcutaneously pour prévenir l'enflure et l'inflammation du cerveau ^11. Se raser les cheveux sur le crâne entre les oreilles, et stériliser la peau avec gommage bétadine et trois tampons en alternance de l'éthanol à 70%.
3. Montez l'animal à un stade chirurgie stéréotaxique avec earbars, avec un coussin chauffant à circulation d'eau ci-dessous l'ensemble des animaux à 37 ° C. Vérifiez régulièrement les niveaux d'anesthésie de l'animal, et compléter la dose initiale anesthésie si nécessaire.
4. Injecter 200 pi de Marcaïne 0,5% sous la peau du cuir chevelu pour engourdir la région. Inciser la peau et retirer le lambeau de peau sur le crâne. Retirez le périoste et sécher la zone avec des cotons-tiges propres.

2. Chronique chirurgie crânienne fenêtre

1. Utiliser une perceuse à grande vitesse dentaire avec une fraise de 0,5 mm à décrire un cercle délicatement 3-5 mm de diamètre sur la région du cerveau d'intérêt. Périodiquement, mouiller avec le site de forage stérile poussière d'os saline à 0,9% et claire loin avec des cotons-tiges propres. Si les saignements osseux, utilisez gelfoam préalablement trempés avec une solution saline stérile pour effacer la purge et attendre que ça s'arrête.
2. Lorsque la couche d'os dernière est atteinte, soulever et retirer l'île os avec pointe fine pince. Dura pièces jointes à l'étagère inférieure de l'os peut se produire si la fenêtre traverse une suture osseuse. Ceux-ci devraient être éliminées en douceur comme le volet osseux est levée.
3. Rouleau mousse de gel humide doucement sur ​​la dure-mère exposée à nettoyer sa surface et attendre que le saignement dure-mère d'arrêter étape critique:. Ne commencera pas avant que tout saignement s'est arrêté dural. Sang qui se retrouve piégé à l'intérieur de la fenêtre crânienne conduit généralement à une fenêtre opaque.
4. Si la région d'intérêt est sous un emplacement où la durée est particulièrement épais, enlever la dure-mère ci-dessus, il peut être nécessaire. Si c'est le cas, séparez doucement la durée de la pie-dessous avec des pinces très fines, faire une petite incision dans la levée dure-mère avec une autre paire de pinces fines, puis saisissez les bords coupés et doucementdiviser la dure-mère. La dure-mère est mince mais solide, donc soyez prudent de ne pas trancher le cerveau avec les bords intacts de la dure-mère.
5. Rincer la zone avec ACSF stérile ou une solution saline stérile.
6. Posez une lamelle de verre stérile (3-5 mm) au cours de la dure-mère ou pia étape critique:. Si les courbes du crâne entourant de manière significative, utilisez Kwiksil colle ¹² pour remplir des espaces où la mère ou pia serait pas en contact étroit avec la lamelle dans les régions qui ne sera pas mis en image.
7. Utiliser un gel cyanoacrylate à couvrir l'adhésif élastomère et les bords de la lamelle couvre-objet en verre. Couvrir l'ensemble du crâne exposé au gel cyanoacrylate, ou un mélange de ciment et de soins dentaires krazyglue étape critique:. Ne laissez pas n'importe quel gel cyanoacrylate de toucher la surface du cerveau.
8. Intégrer un bar sur mesure en métal tête de fixation à l'extrémité opposée du crâne.
9. Le réexpédier vers une chambre de récupération à chaud, après une injection intrapéritonéale de kétoprofène, 5 mg / kg, fogestion de la douleur r. Continuer l'analgésique deux jours de plus après l'opération.
10. Après deux semaines de récupération post-opératoire, anesthésie de l'animal à l'isoflurane (5% pour l'induction, 1,5% pour la maintenance), le monter dans une platine de microscope sur mesure avec un châssis de tête de fixation et vérifiez la fenêtre crânienne pour plus de clarté optique sous illumination avec une lumière bleue. Surface des vaisseaux sanguins du cerveau clarté est très révélateur de la qualité de fenêtre crânienne. Si les bords des vaisseaux sanguins sont nettement définies, la fenêtre est susceptible d'être utilisables. Le temps de deux semaines de récupération post-opératoire est recommandé de laisser suffisamment de temps pour que l'animal récupérer de la chirurgie. Fenêtres crâniens généralement nettoyer et améliorer pendant ce temps, et restent optiquement transparent pendant des semaines à des mois supplémentaires avant que le regain du crâne ou un épaississement de la dure-mère dégrade la qualité de la fenêtre.

3. Protocole de comportement et à balayage laser microscopie à deux photons

1. Les animaux atteints clair cranial fenêtres seront exposés à un stimulus environnemental ou soumis à une session de formation comportementale, puis imagée après au moment du maximum Arc-GFP expression. Avant de commencer un protocole de comportement, l'animal doit être gardé dans un environnement cage cohérente afin de minimiser au jour le jour la variation des niveaux de référence d'expression Arc-GFP.
2. Commencer la formation comportementale ou paradigmes de stimulation de l'environnement, en fonction de la région cérébrale d'intérêt. Par exemple, les animaux peuvent être exposés à différents environnements visuels sur des jours consécutifs, et imager chaque jour après la stimulation visuelle pour identifier les stimulus-réponse spécifique dans le cortex visuel ^10.
3. Arc-fluorescence de la GFP dans les neurones atteint généralement son niveau maximum deux heures après la stimulation. Le calendrier expérimental peut être optimisée afin de faciliter la détection d'Arc-GFP expression dans les neurones à leurs niveaux de fluorescence de pointe.
4. Après une session de formation comportementale ou environnementastimulation l est terminée, anesthésier l'animal avec de l'isoflurane (5% pour l'induction, 1,5% pour la maintenance) et monter l'animal dans la platine du microscope sur mesure avec tête de fixation cadre, sous le microscope à deux photons.
5. Position de la tête de l'animal est fixé sur le cadre de tête de fixation qui se connecte directement à l'étape, à l'aide de la barre métallique implanté sur la boîte crânienne. L'isoflurane et l'oxygène sont fournis en continu à la souris par un cône de nez. La température du corps est maintenue à l'aide d'un coussin chauffant.
6. Assurez-vous que les détecteurs de microscope sont protégés de la lumière ambiante en effectuant balayage laser à deux photons dans une pièce sombre. Utilisez un objectif 20x ou 25x eau (1,05 ouverture numérique) d'immersion pour l'imagerie. Tout d'abord, sous l'épifluorescence illumination, acquérir une image de motifs de surface du vaisseau sanguin dans le cerveau de la région d'intérêt avec une caméra CCD pour l'alignement d'image future.
7. Commencer à deux photons laser à balayage pour acquérir une pile d'images 3-D. Un FV1000 OlympusMPE multi-photon microscope est utilisé dans notre configuration. La longueur d'onde d'excitation du laser à deux photons est réglé à 920 nm, et la puissance du laser émise à partir de l'objectif est fixé à environ 50 mW. Fluorescence émise est simultanément détectée dans les canaux vert et rouge (miroir dichroïque à 570 nm, des filtres barrières à 495-540 nm et 570-625 nm), en utilisant un canal externe de deux systèmes de détection photomutiplier placé à proximité du spécimen. Arc-fluorescence de la GFP apparaît uniquement dans le canal vert, tandis que le tissu auto-fluorescence apparaît dans les deux canaux ^{13, 14.}
8. Piles d'images typiques ont des dimensions d'environ 320x320x100 um (largeur x longueur x profondeur), une résolution horizontale de 0,5 um / pixel, et une résolution verticale de 3 um / pixel.
9. Après l'acquisition de la pile d'images, le retour de l'animal à sa cage. Ne pas déranger l'animal jusqu'à la prochaine session de comportement et d'imagerie. Répétez le comportement et la procédure d'imagerie au fil des jours comme souhaitableed. Utilisez la surface préalablement acquis des vaisseaux sanguins du cerveau l'image d'orienter vers l'emplacement d'imagerie même.

Ce protocole décrit une méthode pour suivre l'expérience qui dépendent des changements moléculaires dans les différents neurones corticaux dans les animaux vivants. Une fenêtre crânienne chronique est d'abord créé sur une région corticale d'intérêt dans une souris portant un rapporteur fluorescent de l'expression génique. Microscopie à deux photons peut ensuite être couplé avec divers paradigmes comportementaux pour observer comportemental induit des changements moléculaires dans les neurones individuels et de suivre de tels changements dans les mêmes ensembles de neurones sur plusieurs jours (figure 1).

Dans Arc-GFP souris, l'expérience des changements liés à l'expression du gène Arc de manière fiable imagée dans les différents neurones corticaux pour plusieurs jours en utilisant ce protocole. La transgénique Arc-GFP souris knock-in exprime une protéine fluorescente verte déstabilisé (d2EGFP, protéines de demi-vie d'environ deux heures) sous le contrôle du promoteur endogène de l'arc du gène précoce immédiat (figure 2).

Après récupération de la chirurgie fenêtre crânienne, les animaux sont montés dans un sur-mesure tête de fixation châssis et la scène. Figure 3 représente la headbar et tête de fixation de trame utilisé lors de l'imagerie à deux photons. Maintenir une cohérence à deux photons position de la platine du microscope d'imagerie et d'installation de faciliter au jour le jour réalignement des images lors du retour à une région du cerveau précédemment imagée, et accroître l'efficacité expérimentale lorsque plusieurs animaux sont imagés le même jour (figure 4).

Au cours de la formation comportementale ou la stimulation de l'environnement, il est conseilléà abriter des animaux individuellement, et dans un endroit cage environnement cohérent, afin de minimiser au jour le jour les fluctuations des niveaux de fond d'activation Arc-GFP (Figure 1).

Un signe important d'une écurie, fenêtre crânienne clair, c'est le modèle nette des vaisseaux sanguins sous épi-fluorescence éclairage. Ce modèle de vaisseau sanguin ne devrait pas changer de manière significative sur plusieurs jours d'imagerie (figure 5).

La figure 6 illustre les profils d'expression de l'Arc-GFP dans les neurones corticaux frontaux sous une condition de base à domicile cage (A) et après l'exécution d'un comportement nouveau moteur (B). Couche II / III neurones corticaux dans la même région cérébrale chez le même animal peut être imagé de manière fiable, et les mêmes neurones doit pouvoir être identifié sur plusieurs jours d'imagerie. Il est courant de rassembler une pile d'images 3-D à des centaines d'échantillons de neurones. Bords de neurones doit être nette et claire tout au long de l'image samure. Tissu auto-fluorescence dans le canal rouge fournit également un indice de clarté fenêtre. Si la région imagée devient considérablement plus trouble au fil des jours, la qualité de fenêtre crânienne est probablement détériorée. Une fenêtre classique crânienne restera optiquement claire pendant au moins une semaine. Après plusieurs semaines à plusieurs mois, la repousse du crâne par rapport aux bords de la fenêtre crânienne et l'épaississement de la dure-mère éventuellement empêcher des expériences d'imagerie complémentaires.

Figure 1. Un schéma décrivant les mesures expérimentales. Pendant la phase de préparation des animaux, les chirurgies fenêtre crâniens sont effectuées sur des souris Arc-GFP. Les animaux reçoivent environ deux semaines pour se remettre de la chirurgie dans leur cage. La clarté de l'crânienne fenêtres est ensuite vérifiée à l'aide de microscopie à épifluorescence. Si les fenêtres sont prêts pour l'imagerie, les animaux sont hébergés individuellement dans un quartier calme, respectueux de l'environnement conformeenvironnement de la cage à la maison, d'où la phase expérimentale Chronologie peut commencer. Le protocole de stimulation comportementale et l'intervalle d'imagerie peut être adapté pour détecter Arc-GFP à son pic de fluorescence, qui se produit généralement deux heures après l'activation. Après la stimulation comportementale est terminé, l'animal est anesthésié et la région corticale d'intérêt est imagée par la fenêtre crânienne en utilisant la microscopie à deux photons. L'animal est ensuite retourné à la cage. Les séances de comportement et d'imagerie peut être répétée au fil des jours comme vous le souhaitez.

Figure 2. Un diagramme illustrant la construction de l'arc-GFP knock-in lignée de souris, dans laquelle un gène codant pour une protéine fluorescente verte déstabilisé remplacé la partie codante du gène précoce immédiat Arc. Dans cette souche de souris, l'expression de GFP sous le contrôle du promoteur endogène d'arc. Ce schéma est redessinée sur la base dela description dans la référence 10.

Figure 3. Schéma et dimensions de la configuration de tête de fixation utilisés pour l'imagerie à deux photons. La moitié de la headbar solide est collé à l'arrière du crâne (article 2,8), et l'extrémité avec le trou de vis est utilisé pour fixer la tête de l'animal anesthésié au châssis. Le cadre de tête de fixation est constitué d'une plaque métallique mince monté au sommet de deux pôles à vis.

Figure 4. Exemple d'une configuration de balayage laser microscope à deux photons pour Arc-GFP imagerie souris. Notez la lentille d'eau 25x à immersion, un coussin chauffant et la platine du microscope personnalisé avec un châssis de tête de fixation. L'anesthésie Arc-GFP souris montré ici est prêt pour l'imagerie in vivo.

Figure 5. Images de vaisseaux cérébraux surface de sang dans une fenêtre crânienne chronique sur plusieurs jours, montrant la clarté et la stabilité des modèles de vaisseaux sanguins au fil du temps. Surface du cerveau a été éclairée par une lumière bleue, et les images ont été prises à travers une lentille 25x immersion dans l'eau par une caméra CCD montée sur le microscope.

Figure 6. In vivo à deux photons des images de profils d'expression Arc-GFP dans les neurones corticaux frontaux de la souris au bout de deux différentes expériences comportementales. (A) La souris resté dans sa cage avant l'imagerie, le premier jour. (B) La souris a effectué un comportement nouveau moteur d'imagerie avant le deuxième jour. Images fluorescentes de la même région corticale ont été acquises simultanément dans les canaux vert et rouge. Fluorescence de la GFP n'est apparu que dans le canal vert, alors que l'autofluorescence tissulaire est apparu dans les deux canaux. Detection paramètres ont été fixés de telle sorte que l'auto-fluorescence des tissus niveaux dans les deux canaux rouge et vert avait lectures égales, et ces paramètres ont été maintenus tout au long des expériences. Le signal du canal rouge est ensuite soustrait du signal de la voie verte pour retirer large bande autofluorescence des tissus au cours de l'analyse hors ligne. Les verts résultant signaux fluorescents provenant environ 18 um d'épaisseur 3-D pile d'images ont été projetées par l'intensité maximale au plan horizontal, afin de fournir une vue de haut en bas des modèles cellulaires d'Arc-GFP expression. La barre d'échelle, 30 um.

L'imagerie in vivo méthode décrite ici permet l'examen répété des changements d'expression des gènes dans l'arc les mêmes ensembles de neurones sur plusieurs jours chez l'animal vivant. Il s'agit d'une méthode efficace et polyvalent pour obtenir des informations sur la plasticité neuronales liées à la dynamique moléculaire dans les neurones individuels en réponse à diverses expériences comportementales. Standard des méthodes histochimiques comme l'hybridation in situ et immunohistochimie peut réaliser une seule cellule de résolution ^3, mais n'ont pas la capacité de suivre les changements d'expression des gènes dans les neurones mêmes sur plusieurs jours. Méthodes d'imagerie par bioluminescence, résonance magnétique, ou nucléaire peut suivre les modifications d'expression des gènes chez le même animal à travers les reporters appropriés ^15, mais n'ont pas la résolution spatiale de distinguer les niveaux d'expression dans les neurones individuels. En tant que tel, pas d'autres méthodes existantes pour mesurer les changements d'expression des gènes peut correspondre à la fois la résolution spatiale et temporelle du couerage de la méthode d'imagerie décrites ici.

Une étape essentielle dans cette procédure est la chirurgie fenêtre crânienne. Il doit être effectué avec un soin particulier pour éviter un traumatisme au cerveau ou de sang laissant sous la lamelle de verre, ce qui cause une inflammation et réduire la clarté des fenêtres crâniens. Pour bien menées chirurgies crâniennes, la fenêtre restera clair pendant plusieurs semaines jusqu'à épaississement de la dure-mère ou la repousse du crâne à partir des bords de la fenêtre d'éviter d'imagerie plus loin. La durée peut être retiré si nécessaire, comme cela a été fait pour les chroniques des expériences d'imagerie optique chez le rat et le singe, ^16,17, pour augmenter la clarté optique des fenêtres crâniens.

Une limitation de la technique de microscopie à deux photons utilisés dans ce protocole est la profondeur d'imagerie. La profondeur maximale à laquelle l'imagerie de haute qualité des images peut être obtenue dépendra de la clarté fenêtre crânienne, la configuration de microscope, et la luminosité de l'fluoresc rents aux journalistes. Pour Arc-GFP souris, nous avons généralement l'image jusqu'à 300 um en dessous de la surface de la pie-mère. D'examiner les changements d'expression génique dans les régions profondes du cerveau, de la fluorescence microendoscopie peut être appliquée pour surmonter la limitation de la profondeur dans classique microscopie à deux photons ^18.

Facteurs de confusion potentiels des changements d'expression de gènes déterminés dans cette méthode d'imagerie in vivo comprennent les effets persistants de la chirurgie crânienne ou une anesthésie qui peuvent interférer avec les performances comportementales ou l'induction de l'Arc-GFP. Il est important de vérifier l'étendue globale de l'Arc-GFP activation en réponse à des expériences spécifiques dans des coupes de cerveau fixes d'abord, et de le comparer à la mesure observée par imagerie in vivo répété en utilisant microscopie à deux photons. La période de récupération post-opératoire et les intervalles d'imagerie répétés peuvent ensuite être ajustés afin de minimiser les effets secondaires potentiels de la chirurgie et de l'anesthésie sur Arc-GFP activation.