piggyBac transposon System Ändring av primära humana T-celler
Summary
Vi beskriver ett förfarande för att genetiskt modifiera primära humana T-celler med en transgen med det icke-virala<em> PiggyBac</em> Transposon systemet. T-celler modifierade för att använda<em> PiggyBac</em> Transposon-system uppvisar stabilt transgenexpression.
Abstract
Det piggyBac transposon systemet är naturligt aktiva, ursprungligen härrör från kål griparen mal 1,2. Denna icke-viralt system är plasmiden baserad, vanligast använda två plasmider med en uttrycker piggyBac transposaset enzymet och en transposon-plasmid hyser genen (generna) av intresse mellan inverterade repetetiva element som krävs för genöverföring aktivitet. PiggyBac förmedlar genöverföring genom en "klippa och klistra"-mekanism varigenom transposaset integrerar transposonen segmentet i genomet hos målcellen (er) av intresse. PiggyBac har visat effektiv aktivitet gentillförsel i en mängd olika insekter 1,2, däggdjurs 3-5, och mänskliga cells6 inklusive primära humana T-celler 7,8. Nyligen har en hyperaktiv piggyBac transposas genereras effektivisering genöverföring 9,10.
Humana T-lymfocyter är av klinisk interest för adoptiv immunterapi av cancer 11. Att notera, har den första kliniska studie med transposon modifiering av humana T-celler med hjälp av Sleeping Beauty transposon godkänts 12. Vi har tidigare utvärderat användbarheten av piggyBac som en icke-viral metodik för genetisk modifiering av mänskliga T-celler. Vi hittade piggyBac att vara effektiv i genetisk modifiering av mänskliga T-celler med en reportergen och en icke-immunogen inducerbar självmordsgen 7. Analys av genomiska integrationsställen avslöjade en brist på preferens för integration i eller nära kända proto-onkogener 13. Vi använde piggyBac till gen-modifiera cytotoxiska T-lymfocyter att bära en chimär antigenreceptor riktad mot tumörantigenet HER2, och fann att gen-modifierade T-celler medierad riktade dödande av HER2-positiva tumörceller in vitro och in vivo i ett ortotopisk musmodell 14. Vi har också använt piggyBacatt generera humana T-celler resistenta mot rapamycin, som bör vara användbara i cancerterapier där rapamycin används 15.
Häri beskriver vi en metod för att använda piggyBac att genetiskt modifiera primära humana T-celler. Detta inbegriper isolering av perifera mononukleära blodceller (PBMC) från humant blod, följt av odling, genmodifiering, och aktivering av T-celler. Vid tillämpningen av denna rapport har T-celler modifierade med en reportergen (EGFP) för analys och kvantifiering av genuttryck genom flödescytometri.
PiggyBac kan användas för att modifiera humana T-celler med en mängd olika gener av intresse. Även om vi har använt piggyBac att styra T-celler till tumörantigener 14 har vi också använt piggyBac att lägga till en switch inducerbart säkerhet för att eliminera genmodifierade celler om det behövs 7. Den stora lastkapacitet på piggyBac har också gjort det möjligt genöverföring aven stor rapamycin resistent mTOR molekyl (15 kb) 15. Därför presenterar vi en icke-viral metod för stabil gen-modifiering av primära humana T-celler för en mängd olika syften.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den metod som beskrivs häri möjliggör stabil transgen modifiering av primära humana T-lymfocyter. Vi har tidigare testat användningen av piggyBac transposonen systemet att modifiera T-celler att uttrycka en reportergen (mer än 4 veckor), en icke-immunogen självmord gen, en chimär antigen receptor för adoptiv immunterapi (mer än 100 dagar), och ingenjör motstånd mot immunsuppressiva läkemedel 7,13-15. Icke-virala modifiering av T-celler för adoptiv immunterapi och andra applikationer bö…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SS stöds delvis av HHMI Med i Grad Training Grant genom TBMM programmet. MHW stöds delvis av en karriärutveckling utmärkelse från Department of Veterans Affairs och generöst stöd av Dr och Mrs Harold M. Selzman. Detta arbete stöddes också delvis av NIH lymfom SPORE bidraget P50CA126752 och NIH R01 DK093660.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5015 | |
| Advanced RPMI 1,640 | LifeTechnologies | 12633020 | |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3008803 | |
| GlutaMAX-I Supplement | LifeTechnologies | 35050-061 | |
| Human IL-15 Recombinant Protein | eBioscience | 14-8159 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Amaxa Nucleofector | Lonza | AAD-1001S | |
| Human T Cell Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1002 | |
| CD8-APC | Southern Biotech | 9536-11 | |
| Anti-Human CD3 | eBioscience | 16-0037-81 | |
| Anti-Human CD28 | BD Pharmingen | 555725 | |
| 24 Well Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 353047 | |
| 24 Well Non Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 351147 | |
| Complete T cell media composition 1x Advanced RPMI 1,640 5% Heat Inactivated Fetal Bovine Serum 2 mM GlutamaxIM-I |
Riferimenti
- Cary, L. C. Transposon mutagenesis of baculoviruses: analysis of Trichoplusia ni transposon IFP2 insertions within the FP-locus of nuclear polyhedrosis viruses. Virology. 172 (1), 156 (1989).
- Fraser, M. J. Assay for movement of Lepidopteran transposon IFP2 in insect cells using a baculovirus genome as a target DNA. Virology. 211 (2), 397 (1995).
- Ding, S. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473 (2005).
- Saridey, S. K. PiggyBac transposon-based inducible gene expression in vivo after somatic cell gene transfer. Mol. Ther. 17 (12), 2115 (2009).
- Nakanishi, H. piggyBac transposon-mediated long-term gene expression in mice. Mol. Ther. 18 (4), 707 (2010).
- Wilson, M. H., Coates, C. J., George, A. L. PiggyBac Transposon-mediated Gene Transfer in Human Cells. Mol. Ther. 15 (1), 139 (2007).
- Nakazawa, Y. Optimization of the PiggyBac transposon system for the sustained genetic modification of human T lymphocytes. J. Immunother. 32 (8), 826 (2009).
- Raja Manuri, P. V. piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for treatment of B-lineage malignancies. Hum. Gene Ther. 21 (4), 427 (2010).
- Doherty, J. E. Hyperactive piggyBac gene transfer in human cells and in vivo. Hum. Gene Ther. , (2011).
- Yusa, K. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (4), 1531 (2011).
- Bonini, C. Genetic modification of T cells. Biol. Blood Marrow Transplant. 17, S15-S20 (2011).
- Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. A transposon and transposase system for human application. Mol. Ther. 18 (4), 1531 (2010).
- Galvan, D. L. Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells. J. Immunother. 32 (8), 837 (2009).
- Nakazawa, Y. PiggyBac-Mediated Cancer Immunotherapy Using EBV-Specific Cytotoxic T-Cells Expressing HER2-Specific Chimeric Antigen Receptor. Mol. Ther. 19 (12), 2133 (2011).
- Huye, L. E. Combining mTor Inhibitors With Rapamycin-resistant T Cells: A Two-pronged Approach to Tumor Elimination. Mol. Ther. 19 (12), 2239 (2011).
- Vera, J. F. Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex). J. Immunother. 33 (3), 305 (2010).
- Kahlig, K. M. Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (4), 1343 (2010).
