שינוי מערכת Transposon piggyBac של תאי T אנושיים ראשוניים
Summary
אנו מתארים שיטה גנטית כדי לשנות את תאי T אנושיים ראשוניים עם transgene שימוש שאינו ויראלי<em> PiggyBac</em> מערכת transposon. תאי T שונים לשימוש<em> PiggyBac</em> Transposon ביטוי transgene מערכת תערוכה יציב.
Abstract
מערכת transposon piggyBac היא טבעי פעילה, המופק ממקור 1,2 כרוב Looper העש. מערכת שאינה נגיפית זה פלסמיד מבוסס, בדרך כלל ניצול שני פלסמידים עם אחד המבטא את אנזים transposase piggyBac וtransposon פלסמיד מטפח את הגן (ים) של עניין בין אלמנטים חוזרים הפוכים אשר נדרשים לפעילות העברת גנים. העברת גנים מתווך PiggyBac דרך מנגנון "גזור ודבק" לפי transposase משלב קטע transposon לתוך הגנום של תא המטרה (הים) של עניין. PiggyBac הוכיח פעילות מסירת גן יעילה במגוון רחב של חרקי 1,2, 3-5 יונקים, ו אדם cells6 לרבות תאי T אנושיים ראשוניים 7,8. לאחרונה, transposase piggyBac היפראקטיבי נוצר שיפור יעילות העברת גני 9,10.
תאי T של אדם הם intere הקלינירח לחיסון מאמצת של 11 סרטן. מן ראוי לציין כי הניסוי הקליני הראשון הכולל שינוי transposon של תאי T אנושיים המשתמשים במערכת transposon היפיפייה הנרדמת אושר 12. יש לנו הערכה בעבר את השירות של piggyBac כהמתודולוגיה שאינה נגיפית הנדסה גנטית של תאי T אנושיים. מצאנו piggyBac להיות יעיל בשינוי הגנטי של תאי T אנושיים עם גן כתב וגן ההתאבדות מושרה אינו immunogenic 7. ניתוח של אתרי אינטגרציה הגנומי חשף חוסר ההעדפה להשתלבות או ליד אונקוגנים פרוטו ידוע 13. אנחנו השתמשנו piggyBac לימפוציטים גנים לשנות ציטוטוקסיות T לבצע קולט אנטיגן chimeric מופנה כנגד אנטיגן גידול HER2, וגילינו כי תאים ששונו גנטי T מתווכים סיכול ממוקדים של תאי גידול מסוג HER2 חיוביים במבחנת in vivo במודל עכבר orthotopic 14. השתמשנו גם piggyBacכדי לייצר תאי T אנושיים עמידים לrapamycin, אשר אמור להיות יעילים בטיפול בסרטן שבי rapamycin מנוצל 15.
בזאת, אנו מתארים שיטה לשימוש piggyBac גנטי כדי לשנות את תאי T אנושיים ראשוניים. זה כולל בידוד של תאי דם היקפיים (mononuclear PBMCs) מדם של בני אדם ואחריו תרבות, שינוי גנטי, והפעלת תאי טי. לצורך הדו"ח זה, תאי T שונו עם גן כתב (eGFP) לניתוח וכימות של ביטוי גנים על ידי cytometry זרימה.
PiggyBac ניתן להשתמש כדי לשנות את תאי T אנושיים עם מגוון רחב של גנים של עניין. למרות שיש לנו להשתמש piggyBac לכוון תאי T לאנטיגנים סרטניים 14, יש לנו גם בשימוש piggyBac להוסיף מתג בטיחות מושרה על מנת לחסל תאים מהונדסים גנטיים במידת צורך 7. קיבולת המטען הגדולה של piggyBac גם אפשרה העברת גנים שלמולקולה גדולה rapamycin עמיד mTOR (15 ק"ג) 15. לכן, אנו מציגים מתודולוגיה שאינה נגיפית לגני שינוי יציב של תאי T האנושיים ראשוניים למגוון רחב של מטרות.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה המתוארת כאן מאפשרת שינוי transgene יציב של לימפוציטים מסוג T האנושי ראשוני. בדקנו את השימוש במערכת transposon piggyBac עבר לשנות תאי T להביע גן כתב (יותר מ 4 שבועות), גן התאבדות אינו immunogenic, קולט אנטיגן chimeric לחיסון מאמצת (ליותר מ 100 ימים), ולהנדס התנגדות לתרופות מדכאות חיסון …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
האס נתמך בחלקו על ידי HHMI המד לגראד ההדרכה גרנט באמצעות תכנית TBMM. MHW נתמך בחלקו על ידי פרס קריירת פיתוח מהמחלקה לענייני יוצאי הצבא ותמיכתה הנדיבה של ד"ר והגב 'הרולד Selzman. עבודה זו נתמכה גם בחלקו על ידי המכון הלאומי לבריאות לימפומה נבג המענק P50CA126752 וNIH R01 DK093660.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5015 | |
| Advanced RPMI 1,640 | LifeTechnologies | 12633020 | |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3008803 | |
| GlutaMAX-I Supplement | LifeTechnologies | 35050-061 | |
| Human IL-15 Recombinant Protein | eBioscience | 14-8159 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Amaxa Nucleofector | Lonza | AAD-1001S | |
| Human T Cell Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1002 | |
| CD8-APC | Southern Biotech | 9536-11 | |
| Anti-Human CD3 | eBioscience | 16-0037-81 | |
| Anti-Human CD28 | BD Pharmingen | 555725 | |
| 24 Well Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 353047 | |
| 24 Well Non Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 351147 | |
| Complete T cell media composition 1x Advanced RPMI 1,640 5% Heat Inactivated Fetal Bovine Serum 2 mM GlutamaxIM-I |
Riferimenti
- Cary, L. C. Transposon mutagenesis of baculoviruses: analysis of Trichoplusia ni transposon IFP2 insertions within the FP-locus of nuclear polyhedrosis viruses. Virology. 172 (1), 156 (1989).
- Fraser, M. J. Assay for movement of Lepidopteran transposon IFP2 in insect cells using a baculovirus genome as a target DNA. Virology. 211 (2), 397 (1995).
- Ding, S. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473 (2005).
- Saridey, S. K. PiggyBac transposon-based inducible gene expression in vivo after somatic cell gene transfer. Mol. Ther. 17 (12), 2115 (2009).
- Nakanishi, H. piggyBac transposon-mediated long-term gene expression in mice. Mol. Ther. 18 (4), 707 (2010).
- Wilson, M. H., Coates, C. J., George, A. L. PiggyBac Transposon-mediated Gene Transfer in Human Cells. Mol. Ther. 15 (1), 139 (2007).
- Nakazawa, Y. Optimization of the PiggyBac transposon system for the sustained genetic modification of human T lymphocytes. J. Immunother. 32 (8), 826 (2009).
- Raja Manuri, P. V. piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for treatment of B-lineage malignancies. Hum. Gene Ther. 21 (4), 427 (2010).
- Doherty, J. E. Hyperactive piggyBac gene transfer in human cells and in vivo. Hum. Gene Ther. , (2011).
- Yusa, K. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (4), 1531 (2011).
- Bonini, C. Genetic modification of T cells. Biol. Blood Marrow Transplant. 17, S15-S20 (2011).
- Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. A transposon and transposase system for human application. Mol. Ther. 18 (4), 1531 (2010).
- Galvan, D. L. Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells. J. Immunother. 32 (8), 837 (2009).
- Nakazawa, Y. PiggyBac-Mediated Cancer Immunotherapy Using EBV-Specific Cytotoxic T-Cells Expressing HER2-Specific Chimeric Antigen Receptor. Mol. Ther. 19 (12), 2133 (2011).
- Huye, L. E. Combining mTor Inhibitors With Rapamycin-resistant T Cells: A Two-pronged Approach to Tumor Elimination. Mol. Ther. 19 (12), 2239 (2011).
- Vera, J. F. Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex). J. Immunother. 33 (3), 305 (2010).
- Kahlig, K. M. Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (4), 1343 (2010).
