piggyBac转座子初级人类T细胞系统改造
Summary
我们描述了一种方法，初级人类T细胞的转基因使用的非病毒基因修饰<em>座子</em>转座子系统。修改，以使用的T细胞<em>座子</em转座系统具有稳定的转基因表达。
Abstract
piggyBac转座子系统自然是积极的，最初来自甘蓝尺蠖蛾1,2。质粒基于此非病毒的系统，是最常用的利用两个质粒与表达一个的piggyBac转座酶和转座子的质粒转染的基因（s）之间的反向重复元件所必需的基因转移活性景点PiggyBac转介导的基因转移通过“剪切和粘贴”机制转座整合到基因组中的目标小区（s）的权益。转座子段PiggyBac转已表现出高效率的基因转运活性在多种昆虫1,2，哺乳动物3-5，和人cells6包括初级人类T细胞7,8。近日，“恨铁不成钢”的座子转座产生，提高转基因效率9,10。
人类T淋巴细胞的临床欢迎有兴趣过继免疫治疗癌症的11日。值得注意的是，第一次临床试验涉及使用睡美人转座子系统的人类T细胞的转座子修改已批准12。我们先前已经评价piggyBac的人类T细胞的遗传修饰的非病毒方法的效用。我们发现piggyBac转是高效率的在带记者基因和非免疫原性诱导的自杀基因7的人类T细胞的遗传修饰。基因组的整合位点的分析，揭示了缺乏或称为原癌基因附近的偏好整合到13。我们使用piggyBac转基因修改细胞毒性T淋巴细胞，以进行针对肿瘤抗原的HER2的嵌合抗原受体，并发现，基因修饰的T细胞介导的有针对性的杀害在原位小鼠模型的HER2阳性肿瘤细胞在体外和体内 14。我们也使用座子以产生耐雷帕霉素的人类T细胞，这应该是有用的癌症疗法，其中雷帕霉素是利用15。
在这里，我们描述了使用座子基因修饰初级人类T细胞的方法。这包括分离的外周血单核细胞（PBMCs）培养，基因修饰，和活化的T细胞随后从人类血液。对于本报告而言，T细胞进行了修改与一个报告基因（EGFP）基因表达的流式细胞仪分析和量化。
PiggyBac转可用于与感兴趣的基因的各种修改的人T细胞。虽然我们已经使用piggyBac转指示T细胞对肿瘤抗原14，我们也使用piggyBac转添加诱导型安全开关，以消除基因修饰的细胞，如果需要7。大货的piggyBac的能力，也使转基因的大雷帕霉素抗mTOR的分子（15 KB）15。因此，我们提出了一种稳定的基因改性的初级人T细胞，用于各种各样的目的的非病毒方法。
Protocol
Representative Results
Discussion
本文所描述的方法，使稳定的转基因修饰的初级人T淋巴细胞。我们之前测试过的piggyBac转座子系统的使用，修改T细胞表达的报告基因（超过4周），一个非免疫原性自杀的基因，过继免疫治疗的嵌合抗原受体（超过100天），工程师免疫抑制药物的抗7,13-15。非病毒的T细胞过继免疫治疗和其他应用程序的修改应该是更便宜，因此，更广泛地利用比逆转录病毒转导。新的过动座子?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SS支持到研究生培训津贴由霍华德休斯医学研究所医学通过TBMM计划的一部分。 MHW是支持的，部分的职业发展奖的博士和夫人的Harold M. Selzman从退伍军人事务部的大力支持。也支持这项工作是由美国国立卫生研究院淋巴瘤SPORE授予P50CA126752和NIH R01 DK093660。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5015 | |
| Advanced RPMI 1,640 | LifeTechnologies | 12633020 | |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3008803 | |
| GlutaMAX-I Supplement | LifeTechnologies | 35050-061 | |
| Human IL-15 Recombinant Protein | eBioscience | 14-8159 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Amaxa Nucleofector | Lonza | AAD-1001S | |
| Human T Cell Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1002 | |
| CD8-APC | Southern Biotech | 9536-11 | |
| Anti-Human CD3 | eBioscience | 16-0037-81 | |
| Anti-Human CD28 | BD Pharmingen | 555725 | |
| 24 Well Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 353047 | |
| 24 Well Non Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 351147 | |
| Complete T cell media composition 1x Advanced RPMI 1,640 5% Heat Inactivated Fetal Bovine Serum 2 mM GlutamaxIM-I |
Riferimenti
- Cary, L. C. Transposon mutagenesis of baculoviruses: analysis of Trichoplusia ni transposon IFP2 insertions within the FP-locus of nuclear polyhedrosis viruses. Virology. 172 (1), 156 (1989).
- Fraser, M. J. Assay for movement of Lepidopteran transposon IFP2 in insect cells using a baculovirus genome as a target DNA. Virology. 211 (2), 397 (1995).
- Ding, S. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473 (2005).
- Saridey, S. K. PiggyBac transposon-based inducible gene expression in vivo after somatic cell gene transfer. Mol. Ther. 17 (12), 2115 (2009).
- Nakanishi, H. piggyBac transposon-mediated long-term gene expression in mice. Mol. Ther. 18 (4), 707 (2010).
- Wilson, M. H., Coates, C. J., George, A. L. PiggyBac Transposon-mediated Gene Transfer in Human Cells. Mol. Ther. 15 (1), 139 (2007).
- Nakazawa, Y. Optimization of the PiggyBac transposon system for the sustained genetic modification of human T lymphocytes. J. Immunother. 32 (8), 826 (2009).
- Raja Manuri, P. V. piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for treatment of B-lineage malignancies. Hum. Gene Ther. 21 (4), 427 (2010).
- Doherty, J. E. Hyperactive piggyBac gene transfer in human cells and in vivo. Hum. Gene Ther. , (2011).
- Yusa, K. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (4), 1531 (2011).
- Bonini, C. Genetic modification of T cells. Biol. Blood Marrow Transplant. 17, S15-S20 (2011).
- Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. A transposon and transposase system for human application. Mol. Ther. 18 (4), 1531 (2010).
- Galvan, D. L. Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells. J. Immunother. 32 (8), 837 (2009).
- Nakazawa, Y. PiggyBac-Mediated Cancer Immunotherapy Using EBV-Specific Cytotoxic T-Cells Expressing HER2-Specific Chimeric Antigen Receptor. Mol. Ther. 19 (12), 2133 (2011).
- Huye, L. E. Combining mTor Inhibitors With Rapamycin-resistant T Cells: A Two-pronged Approach to Tumor Elimination. Mol. Ther. 19 (12), 2239 (2011).
- Vera, J. F. Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex). J. Immunother. 33 (3), 305 (2010).
- Kahlig, K. M. Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (4), 1343 (2010).
