기본 인간 T 세포 piggyBac Transposon 시스템 변경
Summary
우리는 유전자 비 바이러스를 사용하여 transgene과 기본 인간의 T 세포를 수정하는 방법을 설명<em> piggyBac</em> transposon 시스템입니다. T 세포는를 사용하여 수정<em> piggyBac</em> transposon 시스템 전시 안정적인 transgene 표현.
Abstract
piggyBac transposon 시스템은 원래 양배추 자벌레 나방의 1,2에서 파생, 자연적으로 활성화됩니다. 이 비 바이러스 시스템은 가장 일반적으로 하나가 piggyBac transposase 효소 및 유전자 전달 활동에 필요한 역 반복 요소 사이에 관심의 유전자를 (들) 숨겨 플라스미드 transposon을 표현으로 두 plasmids을 활용, 기반 플라스미드입니다. PiggyBac의 mediates 유전자 전송을 통해 transposase 관심의 대상 셀 (들)의 게놈에 transposon 세그먼트를 통합된다 "잘라 내기 및 붙여 넣기"메커니즘이 있습니다. PiggyBac 3-5 포유류의 곤충 1,2의 다양한 효율적인 유전자 전달 활동을 시연하고있다 7,8 차 인간의 T 세포를 포함 cells6 인간. 최근 활동적인 piggyBac의 transposase는 유전자 전달 효율을 향상 9,10 생성되었습니다.
인간 T 림프구는 임상 intere의 역할암 (11)의 입양 immunotherapy에 대한 ST. 참고 중, 잠자는 숲속의 미녀의 transposon 시스템을 사용하여 인간의 T 세포의 transposon 수정을 포함한 첫 번째 임상 실험은 12을 승인했습니다. 우리는 이전에 인간의 T 세포의 유전자 변형에 대한 비 바이러스 성 방법으로 piggyBac의 유틸리티를 평가하고 있습니다. 우리는 리포터 유전자와 비 immunogenic inducible 자살 유전자 7 인간의 T 세포의 유전자 변형에 효율이 piggyBac 발견했다. 게놈 통합 사이트의 분석은 13로 또는 알려진 proto-oncogenes 근처 통합 환경의 부족을 공개했다. 우리는 종양 항원 HER2에 대한 감독 키메라 항원 수용체를 수행하는 유전자 – 수정 세포 독성 T 림프구에 piggyBac 사용하고, 유전자 수정 된 T 세포가 orthotopic 마우스 모델에서 체외 및 생체 내 HER2-양성 종양 세포의 살인을 대상으로 중재 것을 발견 14. 우리는 또한 piggyBac을 사용한rapamycin은 15 활용 암 치료에 도움이 될 것 rapamycin에 강한 인간의 T 세포를 생성 할 수 있습니다.
여기, 우리는 유 전적으로 인간의 기본 T 세포를 수정 piggyBac을 사용하는 방법을 설명합니다. 이 문화, 유전자 수정, 및 T 세포의 활성화에 이어 인간의 피에서 말초 혈 mononuclear 세포 (PBMCs)의 절연을 포함하고 있습니다. 이 보고서의 목적을 위해, T 세포는 유동 세포 계측법에 의한 유전자 발현의 분석 및 정량화를위한 리포터 유전자 (eGFP)로 수정되었습니다.
PiggyBac는 관심 유전자의 다양한 인간의 T 세포를 수정하는 데 사용할 수 있습니다. 우리가 종양 항원 14 T 세포를 직접 할 수 piggyBac 사용했지만, 우리는 또한 7 필요한 경우 유전자 변형 세포를 제거하기 위해 inducible 안전 스위치를 추가 할 수 piggyBac 사용했습니다. piggyBac의 대형화물 용량은 유전자 전송을 사용하고 있습니다큰 rapamycin의 방지를 mTOR 분자 (15 KB) 15. 따라서, 우리는 목적으로 다양한 종류의에 대한 일차적 인간의 T 세포의 안정적인 유전자 변형에 대한 비 바이러스 방법론을 제시한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 된 방법은 기본 인간 T 림프구의 안정적인 transgene의 수정이 가능합니다. 우리는 이전에 리포터 유전자 (4 개 이상의 주), 비 immunogenic 자살 유전자 입양 immunotherapy에 대한 키메라 항원 수용체를 (100 개 이상의 일), 표현하는 T 세포를 수정하는 piggyBac transposon 시스템의 사용을 테스트 한 그리고 면역 억제 약물 7,13-15에 대한 내성을 처리합니다. 입양 immunotherapy 및 기타 응용 …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SS는 TBMM 프로그램을 통해 그라드 교육 교부금에 HHMI 메드에 의해 부분적으로 지원됩니다. MHW는 재향 군인의 담당 부서에서 경력 개발 상 박사 부부 해롤드 M. Selzman의 관대 한 지원에 의해 부분적으로 지원됩니다. 이 작품은 NIH 림프종 포자 부여 P50CA126752와 NIH R01 DK093660에 의해 부분적으로 지원되었다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5015 | |
| Advanced RPMI 1,640 | LifeTechnologies | 12633020 | |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3008803 | |
| GlutaMAX-I Supplement | LifeTechnologies | 35050-061 | |
| Human IL-15 Recombinant Protein | eBioscience | 14-8159 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Amaxa Nucleofector | Lonza | AAD-1001S | |
| Human T Cell Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1002 | |
| CD8-APC | Southern Biotech | 9536-11 | |
| Anti-Human CD3 | eBioscience | 16-0037-81 | |
| Anti-Human CD28 | BD Pharmingen | 555725 | |
| 24 Well Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 353047 | |
| 24 Well Non Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 351147 | |
| Complete T cell media composition 1x Advanced RPMI 1,640 5% Heat Inactivated Fetal Bovine Serum 2 mM GlutamaxIM-I |
Riferimenti
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