piggyBac Transposon modifica del sistema di cellule primarie umane T
Summary
Descriviamo un metodo per modificare geneticamente primarie cellule T umane con un transgene utilizzando il non virale<em> PiggyBac</em> Trasposone sistema. Cellule T modificata per usare la<em> PiggyBac</em> Trasposone mostra sistema stabile espressione del transgene.
Abstract
Il sistema piggyBac trasposoni è naturalmente attivo, originariamente derivato dal 1,2 cavolo crochet falena. Questo non virale sistema è basato plasmide, più comunemente utilizzando due plasmidi con uno esprimere l'enzima piggyBac trasposasi e un trasposone plasmide ospitare il gene (s) di interesse tra elementi ripetute invertite che sono necessarie per l'attività di trasferimento genico. PiggyBac trasferimento genico media attraverso un meccanismo "taglia e incolla" che la trasposasi integra il segmento trasposoni nel genoma della cellula bersaglio (s) di interesse. PiggyBac è dimostrato efficace attività consegna del gene in una vasta gamma di 1,2 insetto, mammifero 3-5, e umano cells6 inclusione dei linfociti T umani 7,8. Recentemente, un trasposasi iperattivo piggyBac è stata generata migliorare l'efficienza di trasferimento genico 9,10.
Linfociti T umani sono di intere clinicast per l'immunoterapia adottiva del cancro 11. Da segnalare, il primo studio clinico che ha coinvolto la modifica trasposone delle cellule T umane che utilizzano il sistema di trasposoni Sleeping Beauty è stato approvato 12. Abbiamo precedentemente valutato l'utilità della piggyBac come non virale metodologia per modificazione genetica di cellule T umane. Abbiamo trovato piggyBac essere efficiente una modificazione genetica di cellule T con un gene reporter e un non immunogeno gene suicida inducibile 7. Analisi dei siti di integrazione genomica ha rivelato una mancanza di preferenza per l'integrazione in zona di noti proto-oncogeni 13. Abbiamo usato piggyBac per modificare gene-linfociti T citotossici per trasportare un antigene recettore chimerico diretto contro l'antigene tumorale HER2, e trovato che geni modificati cellule T mediato mirata uccisione delle cellule tumorali HER2-positivi in vitro e in vivo in un modello di topo ortotopico 14. Abbiamo anche utilizzato piggyBacper generare cellule T resistenti alla rapamicina, che dovrebbero essere utili nelle terapie del cancro in cui è utilizzato rapamicina 15.
Qui, si descrive un metodo per utilizzare piggyBac modificare geneticamente primarie cellule T umane. Questo include isolamento delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) da sangue umano seguita dalla cultura, modificazione genetica, e l'attivazione di cellule T. Ai fini della presente relazione, le cellule T sono state modificate con un gene reporter (eGFP) per l'analisi e la quantificazione dell'espressione genica mediante citometria a flusso.
PiggyBac può essere utilizzato per modificare cellule T con una varietà di geni di interesse. Anche se abbiamo usato piggyBac per dirigere le cellule T ad antigeni tumorali 14, abbiamo usato anche piggyBac per aggiungere un interruttore di sicurezza inducibile per eliminare cellule gene modificato se necessario 7. La capacità di carico di grandi dimensioni di piggyBac ha anche permesso di trasferimento genicoun grande rapamicina mTOR molecola resistente (15 kb) 15. Pertanto, presentiamo una non virale metodologia stabile gene-modifica di cellule T umane primarie per una varietà di scopi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo qui descritto consente la modifica stabile del transgene primari linfociti T umani. Abbiamo precedentemente testato l'utilizzo del sistema piggyBac trasposone per modificare le cellule T per esprimere un gene reporter (per più di 4 settimane), un non immunogeno gene suicida, un recettore antigene chimerico per immunoterapia adottiva (per più di 100 giorni), e per progettare la resistenza ai farmaci immunosoppressivi 7,13-15. Non virale modifica di cellule T per l'immunoterapia ado…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SS è sostenuto in parte dal Med HHMI in Grad formazione di sovvenzione attraverso il Programma TBMM. MHW è sostenuto in parte da un premio alla carriera sviluppo dal Department of Veterans Affairs e il generoso sostegno del Dr. Harold e la signora M. Selzman. Questo lavoro è stato supportato anche in parte da linfoma NIH SPORE concessione P50CA126752 e NIH R01 DK093660.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5015 | |
| Advanced RPMI 1,640 | LifeTechnologies | 12633020 | |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3008803 | |
| GlutaMAX-I Supplement | LifeTechnologies | 35050-061 | |
| Human IL-15 Recombinant Protein | eBioscience | 14-8159 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Amaxa Nucleofector | Lonza | AAD-1001S | |
| Human T Cell Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1002 | |
| CD8-APC | Southern Biotech | 9536-11 | |
| Anti-Human CD3 | eBioscience | 16-0037-81 | |
| Anti-Human CD28 | BD Pharmingen | 555725 | |
| 24 Well Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 353047 | |
| 24 Well Non Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 351147 | |
| Complete T cell media composition 1x Advanced RPMI 1,640 5% Heat Inactivated Fetal Bovine Serum 2 mM GlutamaxIM-I |
Riferimenti
- Cary, L. C. Transposon mutagenesis of baculoviruses: analysis of Trichoplusia ni transposon IFP2 insertions within the FP-locus of nuclear polyhedrosis viruses. Virology. 172 (1), 156 (1989).
- Fraser, M. J. Assay for movement of Lepidopteran transposon IFP2 in insect cells using a baculovirus genome as a target DNA. Virology. 211 (2), 397 (1995).
- Ding, S. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473 (2005).
- Saridey, S. K. PiggyBac transposon-based inducible gene expression in vivo after somatic cell gene transfer. Mol. Ther. 17 (12), 2115 (2009).
- Nakanishi, H. piggyBac transposon-mediated long-term gene expression in mice. Mol. Ther. 18 (4), 707 (2010).
- Wilson, M. H., Coates, C. J., George, A. L. PiggyBac Transposon-mediated Gene Transfer in Human Cells. Mol. Ther. 15 (1), 139 (2007).
- Nakazawa, Y. Optimization of the PiggyBac transposon system for the sustained genetic modification of human T lymphocytes. J. Immunother. 32 (8), 826 (2009).
- Raja Manuri, P. V. piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for treatment of B-lineage malignancies. Hum. Gene Ther. 21 (4), 427 (2010).
- Doherty, J. E. Hyperactive piggyBac gene transfer in human cells and in vivo. Hum. Gene Ther. , (2011).
- Yusa, K. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (4), 1531 (2011).
- Bonini, C. Genetic modification of T cells. Biol. Blood Marrow Transplant. 17, S15-S20 (2011).
- Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. A transposon and transposase system for human application. Mol. Ther. 18 (4), 1531 (2010).
- Galvan, D. L. Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells. J. Immunother. 32 (8), 837 (2009).
- Nakazawa, Y. PiggyBac-Mediated Cancer Immunotherapy Using EBV-Specific Cytotoxic T-Cells Expressing HER2-Specific Chimeric Antigen Receptor. Mol. Ther. 19 (12), 2133 (2011).
- Huye, L. E. Combining mTor Inhibitors With Rapamycin-resistant T Cells: A Two-pronged Approach to Tumor Elimination. Mol. Ther. 19 (12), 2239 (2011).
- Vera, J. F. Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex). J. Immunother. 33 (3), 305 (2010).
- Kahlig, K. M. Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (4), 1343 (2010).
