Summary

שינוי מערכת Transposon piggyBac של תאי T אנושיים ראשוניים

Published: November 05, 2012
doi:

Summary

אנו מתארים שיטה גנטית כדי לשנות את תאי T אנושיים ראשוניים עם transgene שימוש שאינו ויראלי<em> PiggyBac</em> מערכת transposon. תאי T שונים לשימוש<em> PiggyBac</em> Transposon ביטוי transgene מערכת תערוכה יציב.

Abstract

מערכת transposon piggyBac היא טבעי פעילה, המופק ממקור 1,2 כרוב Looper העש. מערכת שאינה נגיפית זה פלסמיד מבוסס, בדרך כלל ניצול שני פלסמידים עם אחד המבטא את אנזים transposase piggyBac וtransposon פלסמיד מטפח את הגן (ים) של עניין בין אלמנטים חוזרים הפוכים אשר נדרשים לפעילות העברת גנים. העברת גנים מתווך PiggyBac דרך מנגנון "גזור ודבק" לפי transposase משלב קטע transposon לתוך הגנום של תא המטרה (הים) של עניין. PiggyBac הוכיח פעילות מסירת גן יעילה במגוון רחב של חרקי 1,2, 3-5 יונקים, ו אדם cells6 לרבות תאי T אנושיים ראשוניים 7,8. לאחרונה, transposase piggyBac היפראקטיבי נוצר שיפור יעילות העברת גני 9,10.

תאי T של אדם הם intere הקלינירח לחיסון מאמצת של 11 סרטן. מן ראוי לציין כי הניסוי הקליני הראשון הכולל שינוי transposon של תאי T אנושיים המשתמשים במערכת transposon היפיפייה הנרדמת אושר 12. יש לנו הערכה בעבר את השירות של piggyBac כהמתודולוגיה שאינה נגיפית הנדסה גנטית של תאי T אנושיים. מצאנו piggyBac להיות יעיל בשינוי הגנטי של תאי T אנושיים עם גן כתב וגן ההתאבדות מושרה אינו immunogenic 7. ניתוח של אתרי אינטגרציה הגנומי חשף חוסר ההעדפה להשתלבות או ליד אונקוגנים פרוטו ידוע 13. אנחנו השתמשנו piggyBac לימפוציטים גנים לשנות ציטוטוקסיות T לבצע קולט אנטיגן chimeric מופנה כנגד אנטיגן גידול HER2, וגילינו כי תאים ששונו גנטי T מתווכים סיכול ממוקדים של תאי גידול מסוג HER2 חיוביים במבחנת in vivo במודל עכבר orthotopic 14. השתמשנו גם piggyBacכדי לייצר תאי T אנושיים עמידים לrapamycin, אשר אמור להיות יעילים בטיפול בסרטן שבי rapamycin מנוצל 15.

בזאת, אנו מתארים שיטה לשימוש piggyBac גנטי כדי לשנות את תאי T אנושיים ראשוניים. זה כולל בידוד של תאי דם היקפיים (mononuclear PBMCs) מדם של בני אדם ואחריו תרבות, שינוי גנטי, והפעלת תאי טי. לצורך הדו"ח זה, תאי T שונו עם גן כתב (eGFP) לניתוח וכימות של ביטוי גנים על ידי cytometry זרימה.

PiggyBac ניתן להשתמש כדי לשנות את תאי T אנושיים עם מגוון רחב של גנים של עניין. למרות שיש לנו להשתמש piggyBac לכוון תאי T לאנטיגנים סרטניים 14, יש לנו גם בשימוש piggyBac להוסיף מתג בטיחות מושרה על מנת לחסל תאים מהונדסים גנטיים במידת צורך 7. קיבולת המטען הגדולה של piggyBac גם אפשרה העברת גנים שלמולקולה גדולה rapamycin עמיד mTOR (15 ק"ג) 15. לכן, אנו מציגים מתודולוגיה שאינה נגיפית לגני שינוי יציב של תאי T האנושיים ראשוניים למגוון רחב של מטרות.

Protocol

יום 0 1. בידוד של PBMCs דם אנושי איסוף 20 מ"ל של דם אדם טרי באמצעות venipuncture לתוך צינורות vacutainer Na-ההפרין. דם תערובת והמתקדמת RPMI 1640 ב1:1 (v / v) יחס. <li style=";text-align:righ…

Representative Results

סכמטי להדגים את השלבים בשינוי תאי T אנושיים עם גן כתב (eGFP) הגנטי מוצג באיור 1. פלסמידים אלה זמינים על פי בקשה מהמחברים. Schemtic מדגים את השלבים בלימפוציטים מסוג T האנושי מהונדס גנטי עם גן כתב (eGFP) הוא showin באיור 2. זה הכרחי להפעלת תאי T על מנת לקבל אותם להתחלק,…

Discussion

השיטה המתוארת כאן מאפשרת שינוי transgene יציב של לימפוציטים מסוג T האנושי ראשוני. בדקנו את השימוש במערכת transposon piggyBac עבר לשנות תאי T להביע גן כתב (יותר מ 4 שבועות), גן התאבדות אינו immunogenic, קולט אנטיגן chimeric לחיסון מאמצת (ליותר מ 100 ימים), ולהנדס התנגדות לתרופות מדכאות חיסון …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

האס נתמך בחלקו על ידי HHMI המד לגראד ההדרכה גרנט באמצעות תכנית TBMM. MHW נתמך בחלקו על ידי פרס קריירת פיתוח מהמחלקה לענייני יוצאי הצבא ותמיכתה הנדיבה של ד"ר והגב 'הרולד Selzman. עבודה זו נתמכה גם בחלקו על ידי המכון הלאומי לבריאות לימפומה נבג המענק P50CA126752 וNIH R01 DK093660.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Lympholyte Cedarlane CL5015  
Advanced RPMI 1,640 LifeTechnologies 12633020  
Hyclone Fetal Bovine Serum Fisher Scientific SH3008803  
GlutaMAX-I Supplement LifeTechnologies 35050-061  
Human IL-15 Recombinant Protein eBioscience 14-8159  
EndoFree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362  
Amaxa Nucleofector Lonza AAD-1001S  
Human T Cell Nucleofector Kit Lonza VPA-1002  
CD8-APC Southern Biotech 9536-11  
Anti-Human CD3 eBioscience 16-0037-81  
Anti-Human CD28 BD Pharmingen 555725  
24 Well Tissue Culture Treated Plate BD Falcon 353047  
24 Well Non Tissue Culture Treated Plate BD Falcon 351147  
      Complete T cell media composition
1x Advanced RPMI 1,640
5% Heat Inactivated Fetal Bovine Serum
2 mM GlutamaxIM-I

Riferimenti

  1. Cary, L. C. Transposon mutagenesis of baculoviruses: analysis of Trichoplusia ni transposon IFP2 insertions within the FP-locus of nuclear polyhedrosis viruses. Virology. 172 (1), 156 (1989).
  2. Fraser, M. J. Assay for movement of Lepidopteran transposon IFP2 in insect cells using a baculovirus genome as a target DNA. Virology. 211 (2), 397 (1995).
  3. Ding, S. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473 (2005).
  4. Saridey, S. K. PiggyBac transposon-based inducible gene expression in vivo after somatic cell gene transfer. Mol. Ther. 17 (12), 2115 (2009).
  5. Nakanishi, H. piggyBac transposon-mediated long-term gene expression in mice. Mol. Ther. 18 (4), 707 (2010).
  6. Wilson, M. H., Coates, C. J., George, A. L. PiggyBac Transposon-mediated Gene Transfer in Human Cells. Mol. Ther. 15 (1), 139 (2007).
  7. Nakazawa, Y. Optimization of the PiggyBac transposon system for the sustained genetic modification of human T lymphocytes. J. Immunother. 32 (8), 826 (2009).
  8. Raja Manuri, P. V. piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for treatment of B-lineage malignancies. Hum. Gene Ther. 21 (4), 427 (2010).
  9. Doherty, J. E. Hyperactive piggyBac gene transfer in human cells and in vivo. Hum. Gene Ther. , (2011).
  10. Yusa, K. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (4), 1531 (2011).
  11. Bonini, C. Genetic modification of T cells. Biol. Blood Marrow Transplant. 17, S15-S20 (2011).
  12. Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. A transposon and transposase system for human application. Mol. Ther. 18 (4), 1531 (2010).
  13. Galvan, D. L. Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells. J. Immunother. 32 (8), 837 (2009).
  14. Nakazawa, Y. PiggyBac-Mediated Cancer Immunotherapy Using EBV-Specific Cytotoxic T-Cells Expressing HER2-Specific Chimeric Antigen Receptor. Mol. Ther. 19 (12), 2133 (2011).
  15. Huye, L. E. Combining mTor Inhibitors With Rapamycin-resistant T Cells: A Two-pronged Approach to Tumor Elimination. Mol. Ther. 19 (12), 2239 (2011).
  16. Vera, J. F. Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex). J. Immunother. 33 (3), 305 (2010).
  17. Kahlig, K. M. Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (4), 1343 (2010).

Play Video

Citazione di questo articolo
Saha, S., Nakazawa, Y., Huye, L. E., Doherty, J. E., Galvan, D. L., Rooney, C. M., Wilson, M. H. piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells. J. Vis. Exp. (69), e4235, doi:10.3791/4235 (2012).

View Video