piggyBac Transposon-System Modifikation von primären menschlichen T-Zellen
Summary
Wir beschreiben ein Verfahren zur genetischen Veränderung primären humanen T-Zellen mit einem Transgen unter Verwendung des nicht-viralen<em> PiggyBac</em> Transposon-System. T-Zellen zur Verwendung der modifizierte<em> PiggyBac</em> Transposonsystem Ausstellung stabile Transgenexpression.
Abstract
Die piggyBac Transposonsystem ist natürlich aktiv, ursprünglich aus dem Kohlspannerraupe Motte 1,2 abgeleitet. Diese nicht-viralen Plasmid basierten System ist, am häufigsten unter Verwendung von zwei Plasmide mit einer Expression der Transposase piggyBac Enzym und ein Transposon-Plasmid beherbergt, der das Gen (e) von Interesse zwischen invertierten Wiederholung Elemente, die für den Gentransfer-Aktivität erforderlich sind. PiggyBac vermittelt Gentransfer durch "cut and paste"-Mechanismus, wobei die Transposase integriert das Transposon-Segment in das Genom der Zielzelle (n) von Interesse. piggyBac hat effizienten Gentransfer-Aktivität in einer breiten Vielzahl von Insekten 1,2, Säuger 3-5 gezeigt, und Menschen cells6 einschließlich der primären menschlichen T-Zellen 7,8. Kürzlich wurde ein hyperaktives piggyBac Transposase erzeugt Verbesserung Gentransfereffizienz 9,10.
Menschliche T-Lymphozyten sind von klinischen interest für Immuntherapie von Krebs 11. Zu beachten ist, hat die erste klinische Studie mit Transposon Veränderung der menschlichen T-Zellen mit dem Dornröschen Transposon System 12 zugelassen. Wir haben zuvor die Nützlichkeit piggyBac als nicht-viralen Methoden zur genetischen Modifikation von menschlichen T-Zellen ausgewertet. Wir fanden piggyBac zu einer genetischen Veränderung von menschlichen T-Zellen mit einem Reportergen und eine nicht-immunogene Suizidgen induzierbar 7 effizient. Analyse von genomischen Integration Seiten offenbart einen Mangel an Präferenz für die Integration in oder in der Nähe bekannter Proto-Onkogene 13. Wir verwendeten piggyBac Gen-modify zytotoxische T-Lymphozyten, um einen chimären Antigen-Rezeptor gegen den Tumor-Antigen HER2 gerichteten tragen, und festgestellt, dass Gen-modifizierten T-Zellen gezielt vermittelte Abtötung von HER2-positiver Tumorzellen in vitro und in vivo in einem orthotopen Mausmodell 14. Wir haben auch verwendet piggyBacdie menschliche T-Zellen resistent gegen Rapamycin, die nützlich sein sollen von Krebstherapien, wo Rapamycin 15 ausgenutzt wird zu erzeugen.
Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Verwendung piggyBac genetisch zu verändern primären humanen T-Zellen. Dies beinhaltet Isolation von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) aus menschlichem Blut durch Kultur, genetischen Veränderung, und Aktivierung von T-Zellen folgt. Für die Zwecke dieser Bericht wurden T-Zellen mit einem Reportergen (eGFP) zur Analyse und Quantifizierung der Genexpression durch Durchflusszytometrie modifiziert.
PiggyBac kann zum menschlichen T-Zellen mit einer Vielzahl von Genen von Interesse zu modifizieren. Obwohl wir verwendet piggyBac an T-Zellen gegen Tumorantigene 14 lenken sind, haben wir auch verwendet, um einen induzierbaren piggyBac Sicherheitsschalter zuzusetzen, um Gen-modifizierten Zellen zu eliminieren, wenn nötig 7. Die große Ladekapazität von piggyBac auch Gentransfer aktivierteine große Rapamycin resistenten mTOR-Molekül (15 kb) 15. Daher stellen wir eine nicht-viralen Methodik für stabile Gen-Modifikation von primären humanen T-Zellen für eine Vielzahl von Zwecken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hierin beschriebene Verfahren erlaubt eine stabile Modifikation Transgen von primären humanen T-Lymphozyten. Wir haben zuvor die Verwendung des piggyBac Transposonsystem getestet, um T-Zellen zu modifizieren, um ein Reporter-Gen (für mehr als 4 Wochen), eine nicht-immunogene Suizidgen, einem chimären Antigenrezeptors für adoptive Immuntherapie (länger als 100 Tage) ausdrücken, und um den Widerstand gegen immunsuppressive Medikamente 7,13-15 konstruieren. Nicht-virale Modifikation von T-Zell…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SS wird teilweise durch die HHMI Med in Grad Training Grant durch die TBMM Programm unterstützt. MHW wird teilweise durch einen Career Development Award vom Department of Veterans Affairs und der großzügigen Unterstützung der Dr. and Mrs. Harold M. Selzman unterstützt. Diese Arbeit wurde zum Teil auch von NIH Lymphom SPORE Gewährung P50CA126752 und NIH R01 DK093660 unterstützt.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5015 | |
| Advanced RPMI 1,640 | LifeTechnologies | 12633020 | |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3008803 | |
| GlutaMAX-I Supplement | LifeTechnologies | 35050-061 | |
| Human IL-15 Recombinant Protein | eBioscience | 14-8159 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Amaxa Nucleofector | Lonza | AAD-1001S | |
| Human T Cell Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1002 | |
| CD8-APC | Southern Biotech | 9536-11 | |
| Anti-Human CD3 | eBioscience | 16-0037-81 | |
| Anti-Human CD28 | BD Pharmingen | 555725 | |
| 24 Well Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 353047 | |
| 24 Well Non Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 351147 | |
| Complete T cell media composition 1x Advanced RPMI 1,640 5% Heat Inactivated Fetal Bovine Serum 2 mM GlutamaxIM-I |
Riferimenti
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