Summary

piggyBac转座子初级人类T细胞系统改造

Published: November 05, 2012
doi:

Summary

我们描述了一种方法,初级人类T细胞的转基因使用的非病毒基因修饰<em>座子</em>转座子系统。修改,以使用的T细胞<em>座子</em转座系统具有稳定的转基因表达。

Abstract

piggyBac转座子系统自然是积极的,最初来自甘蓝尺蠖蛾1,2。质粒基于此非病毒的系统,是最常用的利用两个质粒与表达一个的piggyBac转座酶和转座子的质粒转染的基因(s)之间的反向重复元件所必需的基因转移活性景点PiggyBac转介导的基因转移通过“剪切和粘贴”机制转座整合到基因组中的目标小区(s)的权益。转座子段PiggyBac转已表现出高效率的基因转运活性在多种昆虫1,2,哺乳动物3-5,和人cells6包括初级人类T细胞7,8。近日,“恨铁不成钢”的座子转座产生,提高转基因效率9,10。

人类T淋巴细胞的临床欢迎有兴趣过继免疫治疗癌症的11日。值得注意的是,第一次临床试验涉及使用睡美人转座子系统的人类T细胞的转座子修改已批准12。我们先前已经评价piggyBac的人类T细胞的遗传修饰的非病毒方法的效用。我们发现piggyBac转是高效率的在带记者基因和非免疫原性诱导的自杀基因7的人类T细胞的遗传修饰。基因组的整合位点的分析,揭示了缺乏或称为原癌基因附近的偏好整合到13。我们使用piggyBac转基因修改细胞毒性T淋巴细胞,以进行针对肿瘤抗原的HER2的嵌合抗原受体,并发现,基因修饰的T细胞介导的有针对性的杀害在原位小鼠模型的HER2阳性肿瘤细胞在体外体内 14。我们也使用座子以产生耐雷帕霉素的人类T细胞,这应该是有用的癌症疗法,其中雷帕霉素是利用15。

在这里,我们描述了使用座子基因修饰初级人类T细胞的方法。这包括分离的外周血单核细胞(PBMCs)培养,基因修饰,和活化的T细胞随后从人类血液。对于本报告而言,T细胞进行了修改与一个报告基因(EGFP)基因表达的流式细胞仪分析和量化。

PiggyBac转可用于与感兴趣的基因的各种修改的人T细胞。虽然我们已经使用piggyBac转指示T细胞对肿瘤抗原14,我们也使用piggyBac转添加诱导型安全开关,以消除基因修饰的细胞,如果需要7。大货的piggyBac的能力,也使转基因的大雷帕霉素抗mTOR的分子(15 KB)15。因此,我们提出了一种稳定的基因改性的初级人T细胞,用于各种各样的目的的非病毒方法。

Protocol

0天 1。从人血中分离单核细胞收集20毫升的人新鲜血液,使用静脉穿刺到的Na-肝素的真空采血管管。 混合血液和高级的RPMI 1640,在1:1(体积/体积)的比例。 加入到50ml离心管中(25℃)的20毫升淋巴制剂介质。慢慢层25-30毫升血液RPMI 1640混合的lymphoprep顶部。 在400 XG离心40分钟,没有踩刹车。 收集到10毫升的1×PBS(25℃)用一次性移液管的两个不?…

Representative Results

遗传修饰与报告基因(绿色荧光蛋白)的人T淋巴细胞中的步骤的示意性展示图1中所示。这些质粒可根据作者的要求。展示的步骤与报告基因(EGFP)转基因人类T淋巴细胞是一个schemtic舒如图2所示。激活T细胞,以获得它们分裂,扩大和传播文化,这是必要的。修改人类T细胞,然后培养,并用流式细胞仪分析的第1天,7天的基因表达。所示的结果在图3中从一个?…

Discussion

本文所描述的方法,使稳定的转基因修饰的初级人T淋巴细胞。我们之前测试过的piggyBac转座子系统的使用,修改T细胞表达的报告基因(超过4周),一个非免疫原性自杀的基因,过继免疫治疗的嵌合抗原受体(超过100天),工程师免疫抑制药物的抗7,13-15。非病毒的T细胞过继免疫治疗和其他应用程序的修改应该是更便宜,因此,更广泛地利用比逆转录病毒转导。新的过动座子?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

SS支持到研究生培训津贴由霍华德休斯医学研究所医学通过TBMM计划的一部分。 MHW是支持的,部分的职业发展奖的博士和夫人的Harold M. Selzman从退伍军人事务部的大力支持。也支持这项工作是由美国国立卫生研究院淋巴瘤SPORE授予P50CA126752和NIH R01 DK093660。

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Lympholyte Cedarlane CL5015  
Advanced RPMI 1,640 LifeTechnologies 12633020  
Hyclone Fetal Bovine Serum Fisher Scientific SH3008803  
GlutaMAX-I Supplement LifeTechnologies 35050-061  
Human IL-15 Recombinant Protein eBioscience 14-8159  
EndoFree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362  
Amaxa Nucleofector Lonza AAD-1001S  
Human T Cell Nucleofector Kit Lonza VPA-1002  
CD8-APC Southern Biotech 9536-11  
Anti-Human CD3 eBioscience 16-0037-81  
Anti-Human CD28 BD Pharmingen 555725  
24 Well Tissue Culture Treated Plate BD Falcon 353047  
24 Well Non Tissue Culture Treated Plate BD Falcon 351147  
      Complete T cell media composition
1x Advanced RPMI 1,640
5% Heat Inactivated Fetal Bovine Serum
2 mM GlutamaxIM-I

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Saha, S., Nakazawa, Y., Huye, L. E., Doherty, J. E., Galvan, D. L., Rooney, C. M., Wilson, M. H. piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells. J. Vis. Exp. (69), e4235, doi:10.3791/4235 (2012).

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