Summary

Um procedimento otimizado para fluorescência-ativado Isolamento classificação celular (FACS) da Autônomo progenitores neurais a partir de vísceras de ratos fetais

Published: August 17, 2012
doi:

Summary

Um procedimento otimizado para purificar crista neural derivados progenitores neuronais a partir de tecidos fetais de camundongos é descrito. Este método tira partido da expressão a partir de alelos repórter fluorescente para isolar populações discretas por fluorescência-activated separação de células (FACS). A técnica pode ser aplicada para isolar subpopulações neuronais ao longo do desenvolvimento ou a partir de tecidos adultos.

Abstract

Durante o desenvolvimento da crista neural (CN) derivados progenitores neuronais migrar do tubo neural para formar gânglios autonômicos em órgãos viscerais, como o intestino e do trato urinário inferior. Tanto durante o desenvolvimento e em tecidos maduros estas células são muitas vezes muito dispersos ao longo tecidos de modo a que o isolamento de populações discretas usando métodos como a laser de captura de micro-dissecção é difícil. Podem, contudo, ser directamente visualizadas por expressão de repórteres fluorescentes conduzidos a partir de regiões reguladoras de genes específicos de neurónios como tirosina hidroxilase (TH). Nós descrevemos um método optimizado para altos rendimentos de TH + de viável progenitoras neuronais a partir de tecidos de rato fetal viscerais, incluindo intestino e inferior do tracto urogenital (LUT), com base na dissociação e de fluorescência-activated separação de células (FACS).

O gene codifica Th a enzima limitante para a produção de catecolaminas. Entéricas progenitores neuronais começam a expressar TH durção a sua migração no intestino fetal 1 e TH também está presente em um subconjunto de adultos neurónios dos gânglios pélvicos 2-4. O primeiro aparecimento dessa linhagem ea distribuição destes neurónios em outros aspectos da LUT, e seu isolamento não foi descrita. Progenitores neuronais que expressam TH pode ser prontamente visualizadas por expressão de GFP em ratinhos que transportam o transgene construto Tg (Th-EGFP) DJ76Gsat/Mmnc 1. Nós imaged expressão deste transgene em ratinhos fetais para documentar a distribuição de TH + células na LUT desenvolver-se a 15,5 dias pós coito (DPC), designando a manhã de detecção do conector como 0,5 DPC, e observou-se que um subconjunto de células progenitoras neuronais no coalescência pélvica gânglios expressa EGFP.

Para isolar TH LUT + progenitores neuronais, otimizamos métodos que foram inicialmente utilizados para purificar células da crista neural estaminais do intestino do rato fetal 2-6. Esforços anteriores para isolar NC derivados populações invocadosdigestão com um cocktail de colagenase e tripsina para se obter suspensões de células por citometria de fluxo. Nas nossas mãos estes métodos produzido suspensões de células a partir da LUT com viabilidade relativamente baixo. Dada a incidência já baixo de progenitores neuronais nos tecidos fetais LUT, partimos para otimizar métodos de dissociação de tal forma que a sobrevivência da célula nos dissocia finais seriam aumentados. Nós determinamos que a dissociação suave em Accumax (Cell Technologies, Inc Inovadoras), manual de filtragem, classificação e fluxo a baixas pressões nos permitiram alcançar consistentemente maior sobrevivência (> 70% do total de células) com rendimentos posteriores de progenitores neurais suficientes para a análise a jusante. O método descrevemos podem ser amplamente aplicado para isolar uma variedade de populações neuronais a partir de qualquer fetais ou adultos tecidos de murino.

Protocol

1. Preparação de meios de (Todos os passos feito em capuz cultura de tecidos) Combinar o seguinte: 44 L-15 ml de Meio, 0,5 ml 100X penicilina / estreptomicina (P / S), 0,5 ml de 100 mg / ml de Albumina de Soro Bovino (BSA), 0,5 ml de HEPES 1M, 5 ml de água de grau Tissue Culture. Certifique-se de misturar BSA e P / S bem antes de adicionar. Este volume deve ser adequada para a dissociação de até cinco tipos diferentes tecidos. Esse tipo de material será usado no Passo 3,4 para preparar soluções Quenc…

Discussion

Linhas de rato que expressam repórter repórteres fluorescentes estão se tornando amplamente disponível através de múltiplos esforços no murino genética comunidade 1,8,9. Como resultado do método de dissociação ilustrado aqui pode ser amplamente aplicado para o isolamento de discretas subtipos neuronais com base em neurotransmissor ou padrões de expressão de receptor a partir de ambos os tecidos fetais ou adulto. Embora tenhamos optimizado este método baseado na expressão de um transgene repórt…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostariam de agradecer a Catherine Alford para sugestões de dissociação celular e métodos Weller Kevin, Flaherty e David Matlock Bretanha para apoio no Resource Citometria de Fluxo compartilhada no Vanderbilt University Medical Center e Melissa A. Musser de assistência artística com ilustrações. Agradecemos os drs. Jack Mosher e Sean Morrison para o conselho na implementação de isolamento de células progenitoras neuronais. O recurso de Citometria de Fluxo VMC partilhada é suportado pela Ingram Vanderbilt Câncer Center (P30 CA68485) ea Digestive Disease Vanderbilt Research Center (P30 DK058404). Este trabalho foi financiado por recursos do EUA National Institutes of Health bolsas DK064251, DK086594 e DK070219.

Materials

Reagent Name Vendor Catalog number Comments
Accumax Sigma(mfr: Innovative Cell Technologies) A7089-100ML Store frozen in 1 ml aliquots
DNase I Sigma D-4527 Stored frozen at -20 °C 5 mg/ml in 1xHBSS,
(Used in Quench, Quench 1:5)
10X PBS pH 7.4 Gibco 70011-044 Make up to 1x with tissue culture grade water then sterile filter
10X HBSS w/o Ca or Mg Gibco 14185-052 Make up to 1x with tissue culture grade water then sterile filter
Leibovitz’s L-15 medium Gibco 21083027  
Penicillin /Streptomycin 100X Gibco 15140-133 Store aliquoted at -20 °C
BSA Sigma A3912-100G Store aliquoted at -20 °C, 100 mg/ml in water
Biowhittaker 1M HEPES in 0.85% NaCl Lonza 17-737E  
38 μm NITEX Nylon Mesh Membrane Sefar America 3-38/22 Cut into ~3 cm squares. UV treat overnight to sterilize in the tissue culture hood.
7-AAD Invitrogen A1310 1 mg/ml
TRIzol LS Invitrogen 10296-028  
5 ml polystyrene tubes Falcon 352058  
15 ml conical tubes Corning 430790  
Fine Dissecting Forceps Fine Science Instruments 11251-30 Dumont#5 forcep, Dumoxel, standard tip 0.1×0.06mm
Dissecting Spoon Fine Science Instruments 10370-18  

Riferimenti

  1. Gong, S. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
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  4. Bixby, S., Kruger, G. M., Mosher, J. T., Joseph, N. M., Morrison, S. J. Cell-intrinsic differences between stem cells from different regions of the peripheral nervous system regulate the generation of neural diversity. Neuron. 35, 643-656 (2002).
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Citazione di questo articolo
Buehler, D. P., Wiese, C. B., Skelton, S. B., Southard-Smith, E. M. An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice. J. Vis. Exp. (66), e4188, doi:10.3791/4188 (2012).

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