Una procedura ottimizzata per fluorescenza selezione delle cellule attivate (FACS) Isolamento del Sistema Nervoso Autonomo progenitori neurali da organi viscerali di topi fetali
Summary
Una procedura ottimizzata per purificare neurali cresta progenitori neuronali derivate da tessuti fetali del mouse è descritto. Questo metodo sfrutta espressione da alleli reporter fluorescenti per isolare popolazioni discreti fluorescenza selezione delle cellule attivate (FACS). La tecnica può essere applicata per isolare sottopopolazioni neuronali durante lo sviluppo o da tessuti adulti.
Abstract
Durante lo sviluppo cresta neurale (NC) di derivazione progenitori neuronali migrano dal tubo neurale per formare gangli autonomo negli organi viscerali come l'intestino e delle basse vie urinarie. Sia durante lo sviluppo e nei tessuti maturi queste cellule sono spesso disperse in tutta tessuti in modo che l'isolamento delle popolazioni discrete mediante metodi come la cattura laser micro-dissezione è difficile. Possono comunque essere visualizzati direttamente tramite l'espressione di giornalisti fluorescenti guidati da regioni regolatorie dei geni specifici neuroni, come la tirosina idrossilasi (TH). Noi descriviamo un metodo ottimizzato per alte rese di + TH vitale progenitori neuronali da tessuti di topo fetali viscerali, inclusi intestino e inferiore del tratto urogenitale (LUT), basata su fluorescenza dissociazione e selezione delle cellule attivate (FACS).
Il gene codifica per la Th enzima limitante per la produzione di catecolamine. Enterici progenitori neuronali cominciano a esprimere TH durcorso del loro migrazione nell'intestino fetale 1 e TH è anche presente in un sottoinsieme di adulti neuroni gangli pelvico 2-4. La prima comparsa di questa linea e la distribuzione di questi neuroni in altri aspetti della LUT, e il loro isolamento non è stata descritta. Progenitori neuronali che esprimono TH possono essere facilmente visualizzati tramite espressione di EGFP in topi portatori del transgene costrutto Tg (Th-EGFP) DJ76Gsat/Mmnc 1. Abbiamo ripreso espressione di questo transgene nei topi fetali per documentare la distribuzione dei TH + celle nella LUT sviluppando a 15,5 dopo il coito giorni (DPC), che designa la mattina del rilevamento Plug come 0,5 DPC, e ha osservato che un sottoinsieme di progenitori neuronali nel coalescenza pelvica gangli express EGFP.
Per isolare LUT TH + progenitori neuronali, abbiamo ottimizzato metodi che sono stati inizialmente utilizzati per purificare le cellule della cresta neurale staminali da intestino del mouse fetale 2-6. Sforzi precedenti per isolare NC-derivati popolazioni invocatidigestione con un cocktail di collagenasi e tripsina per ottenere sospensioni cellulari per citometria a flusso. Nelle nostre mani questi metodi di sospensioni di cellule prodotte dal LUT con la vitalità relativamente bassa. Data la già bassa incidenza dei progenitori neuronali nei tessuti fetali LUT, abbiamo deciso di ottimizzare i metodi di dissociazione tali che la sopravvivenza delle cellule si dissocia in finale sarebbe aumentato. Abbiamo determinato che la dissociazione dolce in Accumax (Cell Technologies innovative, Inc), manuale di filtraggio, e il flusso di smistamento a basse pressioni ci hanno permesso di ottenere la sopravvivenza sempre maggiore (> 70% delle cellule totali) con rese successivi di progenitori neuronali sufficiente per l'analisi a valle. Il metodo che descriviamo può essere generalmente applicato a isolare una varietà di popolazioni di neuroni da entrambi i tessuti fetali o adulto di topo.
Protocol
Discussion
Linee giornalista del mouse che esprimono giornalisti fluorescenti sono sempre ampiamente disponibili attraverso molteplici sforzi nella genetica murina comunità 1,8,9. Come risultato il metodo dissociazione illustrato qui può essere ampiamente utilizzato per l'isolamento di distinti sottotipi neuronali basato su neurotrasmettitore o pattern di espressione del recettore da entrambi i tessuti fetali o adulto. Mentre ci sono ottimizzate questo metodo basato su espressione di un reporter fluorescente trans…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Catherine Alford per suggerimenti su metodi di dissociazione cellulare e Kevin Weller, David Flaherty e Bretagna Matlock per il supporto nel Resource Citometria a Flusso in comune presso la Vanderbilt University Medical Center e Melissa A. Musser per l'assistenza artistica con illustrazioni. Ringraziamo Drs. Jack Mosher e Sean Morrison per consigli sulla realizzazione di isolamento dei progenitori neuronali. Il VMC Resource Citometria a Flusso in comune è sostenuta dalla Vanderbilt Ingram Cancer Center (P30 CA68485) e la Vanderbilt Digestive Disease Research Center (P30 DK058404). Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento da US National Institutes of sovvenzioni Salute DK064251, DK086594 e DK070219.
Materials
| Reagent Name | Vendor | Catalog number | Comments |
| Accumax | Sigma(mfr: Innovative Cell Technologies) | A7089-100ML | Store frozen in 1 ml aliquots |
| DNase I | Sigma | D-4527 | Stored frozen at -20 °C 5 mg/ml in 1xHBSS, (Used in Quench, Quench 1:5) |
| 10X PBS pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | Make up to 1x with tissue culture grade water then sterile filter |
| 10X HBSS w/o Ca or Mg | Gibco | 14185-052 | Make up to 1x with tissue culture grade water then sterile filter |
| Leibovitz’s L-15 medium | Gibco | 21083027 | |
| Penicillin /Streptomycin 100X | Gibco | 15140-133 | Store aliquoted at -20 °C |
| BSA | Sigma | A3912-100G | Store aliquoted at -20 °C, 100 mg/ml in water |
| Biowhittaker 1M HEPES in 0.85% NaCl | Lonza | 17-737E | |
| 38 μm NITEX Nylon Mesh Membrane | Sefar America | 3-38/22 | Cut into ~3 cm squares. UV treat overnight to sterilize in the tissue culture hood. |
| 7-AAD | Invitrogen | A1310 | 1 mg/ml |
| TRIzol LS | Invitrogen | 10296-028 | |
| 5 ml polystyrene tubes | Falcon | 352058 | |
| 15 ml conical tubes | Corning | 430790 | |
| Fine Dissecting Forceps | Fine Science Instruments | 11251-30 | Dumont#5 forcep, Dumoxel, standard tip 0.1×0.06mm |
| Dissecting Spoon | Fine Science Instruments | 10370-18 |
Riferimenti
- Gong, S. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
- Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells. Cell. 96, 737-749 (1999).
- Kruger, G. M. Neural crest stem cells persist in the adult gut but undergo changes in self-renewal, neuronal subtype potential, and factor responsiveness. Neuron. 35, 657-669 (2002).
- Bixby, S., Kruger, G. M., Mosher, J. T., Joseph, N. M., Morrison, S. J. Cell-intrinsic differences between stem cells from different regions of the peripheral nervous system regulate the generation of neural diversity. Neuron. 35, 643-656 (2002).
- Walters, L. C., Cantrell, V. A., Weller, K. P., Mosher, J. T., Southard-Smith, E. M. Genetic background impacts developmental potential of enteric neural crest-derived progenitors in the Sox10Dom model of Hirschsprung disease. Human Molecular Genetics. , (2010).
- Corpening, J. C. Isolation and live imaging of enteric progenitors based on Sox10-Histone2BVenus transgene expression. Genesis. 49, 599-618 (2011).
- Morrison, S. J. . Isolation of fetal rat neural crest stem cells (NCSC) from gut and sciatic nerve. , (2012).
- Skarnes, W. C. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474, 337-342 (2011).
- Harding, S. D. The GUDMAP database–an online resource for genitourinary research. Development. 138, 2845-2853 (2011).
- Joseph, N. M. Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut. J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).
- Newgreen, D. F., Murphy, M. Neural crest cell outgrowth cultures and the analysis of cell migration. Methods Mol. Biol. 137, 201-211 (2000).
