Summary

Isolamento di cellule cardiache funzionali immunitario

Published: December 05, 2011
doi:

Summary

Questo metodo per isolare le cellule immunitarie funzionale dal cuore offre un'alternativa ai metodi convenzionali di digestione collagenasi, che provoca indesiderati attivazione immunitaria delle cellule, con conseguente diminuzione di risposta di queste cellule. Il nostro metodo di isolamento rese funzionali cellule cardiache immunitario evitando problemi legati alla digestione enzimatica.

Abstract

Cardiaco cellule immunitarie stanno guadagnando interesse per i ruoli che svolgono nella rimodellamento patologico in molte malattie cardiache 1-5 Queste cellule del sistema immunitario, che includono i mastociti, le cellule T ei macrofagi;. Immagazzinare e rilasciare una varietà di mediatori biologici attivi tra cui citochine e proteasi, quali triptasi. 6-8 Questi mediatori hanno dimostrato di essere giocatori chiave nel metabolismo della matrice extracellulare, attivando metalloproteinasi della matrice o causare accumulo di collagene modulando il fibroblasti cardiaci 'funzione. 9-11 Tuttavia, le tecniche disponibili per isolare le cellule immunitarie hanno cardiaca stato problematico perché usano collagenasi batterica per digerire il tessuto miocardico. Questa tecnica causa attivazione delle cellule immunitarie e di conseguenza una perdita di funzione. Per esempio, i mastociti cardiaci diventano significativamente meno sensibili ai composti che causano la degranulazione. 12 Perciò, abbiamo sviluppato una tecnica che permette di tche l'isolamento di cellule cardiache funzionali del sistema immunitario che porterebbe ad una migliore comprensione del ruolo di queste cellule nelle malattie cardiache. 13, 14

Questo metodo richiede una certa familiarità con la posizione anatomica del ratto processo xifoideo, ascella e legamento falciforme, pericardio e del cuore. Questi punti di riferimento sono importanti per aumentare il successo della procedura e per garantire una maggiore resa di cellule immunitarie cardiaco. Queste isolato cellule cardiache immunitarie possono quindi essere utilizzati per la caratterizzazione di funzionalità, fenotipo, la maturità e co-coltura con altri esperimenti cellule cardiache per ottenere una migliore comprensione delle loro interazioni.

Protocol

1. Preparazione della soluzione Balance Hanks 'Salt (HBSS) Autoclave 1 bicchiere di vetro L, 1000 mL cilindro graduato, e mescolare bar. Ricostituire la soluzione polvere HBSS in autoclave L 1 bicchiere di vetro per il marchio di 900 ml con acqua bidistillata. Mescolare soluzione HBSS con 3,4 g di sale Hepes Na + e regolare il pH a un valore compreso tra 7,35-7,41 utilizzando concentrato HCL o NaOH. Una volta che il pH desiderato è stato raggiunto e rimane stabile, aggiunger…

Discussion

Questo metodo di isolare le cellule immunitarie cardiaca permette l'analisi della loro funzione, fenotipo, e la maturità senza l'attivazione indesiderata che si verifica in genere nel corso di una tecnica tradizionale isolamento digestione enzimatica. Il numero medio totale di cellule ottenute con questa tecnica è di circa 400.000 per il cuore di ratto, e colorazione differenziale e l'analisi di citometria a flusso di queste cellule indica popolazione mista di linfociti T (~ 70%), i macrofagi (~ 12%) e mas…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato da una UNCF-Merck tesi di laurea Science Research Fellowship (JLM), National Heart, Lung, and Blood Institute concede RO1-HL-62228 (JSJ) e RO1-HL-073990 (JSJ).

Materials

Name of Reagent and Equipment Company Catalogue Number Comments
Hanks’ Balanced Salt Sigma H4891 One bottle makes 1 L of Hanks’ Balance Salt
Solution. Reconstitute Hanks’ Balance Salt
Solution as a part of the procedure.
Antibiotic- Antimyotic Gibco 15240-062  
HEPES Sigma H3784  
Bovine Serum Albumin Sigma A3912  
250 mL Nalogene Filter Bottle Thermoscientific 157-0020  
12 N HCL Fisher Scientific CAS 7647-01-0 For 6 N, add equal volumes of HCL to deionized water.
10 N NaOH Fisher Scientific SC267 For 5 N, add equal volumes of NaOH to deionized water.
Double Distilled Water      

Table of Specific Equipment:

Name of Reagent and Equipment Company Catalogue Number Comments
3-O Suture Silk Braided Ethicon Products SA64H  
Small Animal Ventilator CWE Incorporated SAR-830 Set breathing rate to 40.5 breaths per min.
Bevel 18 gauge needle BD Biosciences 305199 Trim needle by 1/2 to 3/4 of its original length for use as a tracheal tube.
Teflon Tip (with needle removed) of 24-gauge Baxter quick-cath catheter Baxter 2N111 Reduce the Teflon Tip length by 1/2 to 3/4.
10 cc syringe Fisher Scientific 14-823-16B  
15 mL Falcon Tubes BD Biosciences 352097  
Sorvall RT6000B Refrigerated Centrifuge Fisher Scientific 75-004-377 Remember to pre-cool and keep at 4°C.
Hyclone Thermoscientific S300030.02  
Hemocytometer Hausser Scientific HS-LB-1483  

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
McLarty, J. L., Meléndez, G. C., Spencer, W. J., Levick, S. P., Brower, G. L., Janicki, J. S. Isolation of Functional Cardiac Immune Cells. J. Vis. Exp. (58), e3020, doi:10.3791/3020 (2011).

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