L'<em> C. elegans</emEmbryon> est un système puissant pour étudier la biologie cellulaire et le développement. Nous présentons un protocole pour l'imagerie en direct de<em> C. elegans</em> Embryons en utilisant l'optique DIC ou de fluorescence à l'aide de microscopes à épifluorescence facilement disponibles et les logiciels open-source.
Processus cellulaires, telles que l'assemblage de chromosomes, la ségrégation et la cytokinèse, sont intrinsèquement dynamique. Time-lapse imagerie des cellules vivantes, en utilisant fluorescentes protéines marquées journaliste ou contraste d'interférence différentiel (DIC) microscope, permet à l'examen de la progression temporelle de ces événements dynamiques qui est par ailleurs déduire de l'analyse des échantillons 1,2 fixe. Par ailleurs, l'étude de la réglementation du développement des processus cellulaires nécessite la réalisation de temps-faute des expériences sur un organisme intact pendant le développement. L'embryon Caenorhabiditis elegans est transparent à la lumière et a un rapide, le programme invariant de développement avec une cellule connue lignée 3, offrant ainsi un modèle idéal pour étudier l'expérience des questions de biologie cellulaire et développement 4,5 6-9. C. elegans est modifiable à la manipulation génétique par l'avant génétique (basée sur la mutagenèse aléatoire 10,11) et la génétique inverse pour cibler des gènes spécifiques (basées sur l'ARNi à médiation interférences et ciblées mutagenèse 12-15). En outre, les animaux transgéniques peuvent être facilement créées pour exprimer des protéines par fluorescence étiqueté ou journalistes 16,17. Ces traits se combinent pour rendre plus facile d'identifier les voies génétiques de régulation de processus cellulaires fondamentaux et de développement in vivo 18-21. Dans ce protocole, nous présentons des méthodes pour l'imagerie en direct de C. embryons elegans utilisant l'optique DIC ou fluorescence de la GFP sur un microscope composé épifluorescence. Nous démontrons la facilité avec laquelle les microscopes facilement disponibles, généralement utilisé pour l'imagerie de l'échantillon fixe, peut également être appliquée pour les time-lapse analyse en utilisant des logiciels libres pour automatiser le processus d'imagerie.
Une considération importante pour vivre imagerie time-lapse est de préserver l'intégrité et la viabilité de la cellule et l'organisme. Microscopie DIC offre l'avantage que l'échantillon n'est pas exposée à la lumière ultraviolette et chauffage excessif de la source d'éclairage. Microscopie DIC est bien adapté pour détecter la migration cellulaire et les changements de forme cellulaire telles que la cytocinèse et d'identifier certaines structures subcellulaires, tels que le fuseau mitotique et la membrane nucléaire. L'imagerie de fluorescence des protéines reporters complète de microscopie DIC en identifiant d'autres compartiments subcellulaires et permettant la visualisation des protéines spécifiques. Pour atténuer les risques de phototoxicité et de dommages à l'embryon lors de l'imagerie de fluorescence, nous avons l'habitude d'augmenter le gain de la caméra numérique pour compenser la réduction de l'intensité des UV la lumière et la durée d'éclairement. Pour faibles fluorescentes journalistes transgéniques, les algorithmes de déconvolution pour réaffecter hors-focus algorithmes lumière ou déconvolution de réduire de fond peut améliorer la qualité des images capturées. Alors que les microscopes de pointe comme les systèmes confocale ou multiphotonique sont parfois nécessaires, nous avons constaté que de nombreux journalistes fluorescente peut être imagée en utilisant cette configuration microscope à épifluorescence, produisant des images de haute qualité.
Micro-Manager (http://www.micro-manager.org), en plus d'être gratuit, enregistre les fichiers directement au format TIFF au lieu de formats de fichiers propriétaires de nombreux logiciels commerciaux. Cela simplifie considérablement l'analyse de nos données en éliminant l'étape de conversion de fichiers nécessaires pour lire les fichiers image dans ImageJ, Photoshop et autres logiciels de retouche d'image.
The authors have nothing to disclose.
Interne des fonds institutionnels et les sciences biologiques Scholars Program à l'Université du Michigan ont soutenu ce travail.
Olympus BX61 microscope with Hamamatsu Orca-ER camera. 10x Plan Fluorite (NA 0.3) and 60x PlanAchromat (NA 1.35) objective lenses
Micro-Manager 1.3.46(http://www.micro-manager.org)
Image J 1.43 (http://rsbweb.nih.gov/ij)
loci_tools.jar (http://www.loci.wisc.edu)
Agarose – molecular biology/gel electrophoresis grade
Fisher Superfrost/Plus Microscope Slides (Catalog # 12-550-15)
Laboratory tape (Fisher Catalog # 15-901 Series)
18 mm x 18 mm #1.5 Coverslips
M9 (242 mM KH2PO4, 40 mM Na2HPO4, 9 mM g NaCl, 19 mM NH4Cl MgSO4)
(http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm).
Egg Buffer (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 25 mM HEPES, pH 7.3)25.
Vaseline
Brush/Stick
Razor blades
Heat block
Dissecting microscope
Worms22
Platinum wire pick22
27G1/2 Precision Glide Needle (Beckton Dickinson) or a scalpel with a small blade