و<em> C. ايليجانس</em> الجنين هو نظام قوي لدراسة بيولوجيا الخلايا والتنمية. نقدم بروتوكولا للتصوير حي ل<em> C. ايليجانس</em> استخدام أجنة البصريات مدينة دبي للإنترنت أو استخدام مضان المجاهر epifluorescent متاحة بسهولة والبرمجيات مفتوحة المصدر.
العمليات الخلوية ، مثل العزل الصبغي ، والتجمع ، والحرائك الخلوية ، هي بطبيعتها ديناميكية. الوقت الفاصل بين التصوير من الخلايا الحية ، وذلك باستخدام البروتينات الفلورية المسمى الصحفي أو الفرق المقابل تدخل (DIC) المجهري ، ويسمح لدراسة تطور الزمني لهذه الأحداث الديناميكية التي هي على خلاف ذلك يستدل من تحليل عينات 1،2 الثابتة. وعلاوة على ذلك ، ودراسة لوائح التنموية يتطلب إجراء العمليات الخلوية الوقت الفاصل بين التجارب على كائن حي سليمة خلال التنمية. الجنين ايليجانس Caenorhabiditis خفيفة وشفافة لها ، ثابتة السريع البرنامج الإنمائي مع خلية معروفة النسب 3 ، مما يوفر تجربة نموذج مثالي لدراسة المسائل في بيولوجيا الخلية والتنمية 4،5 6-9. جيم ايليجانس هو قابلة للتعديل الوراثي للتلاعب من قبل الوراثة إلى الأمام (على أساس الطفرات العشوائية 10،11) ، وعلم الوراثة العكسية لاستهداف جينات معينة (على أساس رني بوساطة التدخل واستهدفت الطفرات 12-15). بالإضافة ، يمكن بسهولة خلق حيوانات معدلة وراثيا في التعبير عن بروتينات أو الموسومة fluorescently صحفيين 16،17. هذه الصفات مجتمعة تجعل من السهل التعرف على المسارات الجينية التي تنظم العمليات الخلوية الأساسية والتنموية في الجسم الحي 18-21. في هذا البروتوكول نقدم أساليب التصوير المباشر لجيم ايليجانس أجنة باستخدام البصريات DIC أو مضان GFP على مجهر epifluorescent المجمع. نبدي السهولة التي يمكن أيضا المجاهر متاحة بسهولة ، وتستخدم عادة لتصوير نموذج ثابت ، تطبق على الوقت الفاصل بين التحليل باستخدام برمجيات المصدر المفتوح لأتمتة عملية التصوير.
وهناك اعتبار رئيسي للتصوير مرور الزمن يعيش هو الحفاظ على سلامتها وسلامة الخلية والكائن في. دبي انترناشيونال كابيتال المجهري يوفر الفوائد التي لم يتم كشفها نموذج للأشعة فوق البنفسجية والحرارة المفرطة من مصدر الإضاءة. هي مناسبة تماما للكشف المجهري DIC الهجرة الخلية ويتغير شكل الخلية مثل الحرائك الخلوية والتعرف على بعض الهياكل التحت خلوية ، مثل مغزل الإنقسامية والغشاء النووي. التصوير مضان من البروتينات مراسل يكمل المجهري مدينة دبي للإنترنت عن طريق تحديد الأجزاء التحت خلوية إضافية والسماح التصور للبروتينات محددة. للتخفيف من أخطار وأضرار الضيائية إلى الجنين أثناء التصوير مضان ، ونحن عادة زيادة الربح من الكاميرا الرقمية للتعويض عن انخفاض كثافة الأشعة فوق البنفسجية ومدة الإضاءة. خافت المعدلة وراثيا للصحفيين الفلورسنت ، خوارزميات deconvolution إلى إعادة تعيين من خارج تركيز الضوء أو deblurring خوارزميات للحد من الخلفية يمكن تحسين جودة الصور الملتقطة. بينما المجاهر المتقدمة مثل نظم مبائر multiphoton أو في بعض الأحيان ضرورية ، وجدنا أنه يمكن للصحفيين الفلورسنت تصوير العديد من استخدام هذا الإعداد epifluorescent المجهر ، مما أسفر عن صور ذات جودة عالية.
مدير الدقيقة (http://www.micro-manager.org) ، بالإضافة إلى كونها مجانية ، يحفظ الملفات مباشرة إلى تنسيق TIFF بدلا من تنسيقات الملفات الشخصية لكثير من حزم البرامج التجارية. هذا يبسط كثيرا من تحليلات البيانات المتوفرة لدينا من خلال القضاء على خطوة تحويل ملف اللازمة لقراءة ملفات الصور في ImageJ ، فوتوشوب وغيرها من برامج تحرير الصور.
The authors have nothing to disclose.
بدعم الصناديق المؤسسية الداخلية والبيولوجي برنامج علماء العلوم في جامعة ميشيغان هذا العمل.
Olympus BX61 microscope with Hamamatsu Orca-ER camera. 10x Plan Fluorite (NA 0.3) and 60x PlanAchromat (NA 1.35) objective lenses
Micro-Manager 1.3.46(http://www.micro-manager.org)
Image J 1.43 (http://rsbweb.nih.gov/ij)
loci_tools.jar (http://www.loci.wisc.edu)
Agarose – molecular biology/gel electrophoresis grade
Fisher Superfrost/Plus Microscope Slides (Catalog # 12-550-15)
Laboratory tape (Fisher Catalog # 15-901 Series)
18 mm x 18 mm #1.5 Coverslips
M9 (242 mM KH2PO4, 40 mM Na2HPO4, 9 mM g NaCl, 19 mM NH4Cl MgSO4)
(http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm).
Egg Buffer (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 25 mM HEPES, pH 7.3)25.
Vaseline
Brush/Stick
Razor blades
Heat block
Dissecting microscope
Worms22
Platinum wire pick22
27G1/2 Precision Glide Needle (Beckton Dickinson) or a scalpel with a small blade