Il<em> C. elegans</emEmbrione> è un potente sistema per lo studio della biologia cellulare e dello sviluppo. Vi presentiamo un protocollo per l'imaging dal vivo di<em> C. elegans</em> Embrioni utilizzando ottiche DIC o fluorescenza con microscopi epifluorescente facilmente disponibili e software open-source.
Processi cellulari, come il montaggio dei cromosomi, segregazione e citocinesi, sono intrinsecamente dinamica. Time-lapse imaging di cellule viventi, mediante fluorescenza marcata proteine reporter o contrasto interferenziale differenziale (DIC) microscopia, consente per l'esame della progressione temporale di questi eventi dinamici che altrimenti è dedotto da analisi di campioni fisso 1,2. Inoltre, lo studio della normativa di sviluppo di processi cellulari rende necessario condurre esperimenti di time-lapse su un organismo intatto durante lo sviluppo. L'embrione Caenorhabiditis elegans è leggero trasparente ed ha un rapido programma di sviluppo invariante con una cella conosciuto lignaggio 3, fornendo così un modello ideale esperimento per lo studio delle domande di biologia cellulare e dello sviluppo 4,5 6-9. C. elegans è modificabile alla manipolazione genetica in avanti genetica (sulla base di mutagenesi casuale 10,11) e genetica inversa per indirizzare geni specifici (sulla base di RNAi mediato da interferenze e mirati mutagenesi 12-15). Inoltre, gli animali transgenici possono essere facilmente create per esprimere proteine fluorescenti tag o giornalisti 16,17. Queste caratteristiche si combinano per rendere più facile identificare i percorsi genetici che regolano processi cellulari fondamentali e dello sviluppo in vivo 18-21. In questo protocollo presenteremo i metodi per l'imaging dal vivo di C. embrioni elegans utilizzando ottiche DIC o fluorescenza GFP su un microscopio composto epifluorescente. Dimostriamo la facilità con cui microscopi prontamente disponibili, tipicamente utilizzato per l'imaging campione fisso, può essere applicato anche per time-lapse analisi utilizzando software open-source per automatizzare il processo di imaging.
Una considerazione importante per vivere time-lapse imaging è quello di preservare l'integrità e la vitalità della cellula e dell'organismo. Microscopia DIC offre il vantaggio che il campione non è esposta alla luce ultravioletta e il riscaldamento eccessivo dalla fonte di illuminazione. Microscopia DIC ben si adatta a rilevare la migrazione cellulare e cambia la forma delle cellule, come citocinesi e di individuare alcune strutture subcellulari, come il fuso mitotico e la membrana nucleare. Imaging di fluorescenza di proteine giornalista integra microscopia DIC identificando ulteriori compartimenti subcellulari e consentendo la visualizzazione di proteine specifiche. Per mitigare i rischi di fototossicità e danni per l'embrione durante imaging di fluorescenza, di solito aumentare il guadagno digitale della fotocamera per compensare la ridotta intensità della luce UV e la durata di illuminazione. Per i deboli giornalisti transgenici fluorescenti, gli algoritmi di deconvoluzione per riassegnare out-of-focus algoritmi di luce o deblurring per ridurre sfondo può migliorare la qualità delle immagini catturate. Mentre i microscopi avanzate come i sistemi confocale o multiphoton a volte sono necessarie, abbiamo trovato che molti giornalisti fluorescenti possono essere ripreso questa impostazione epifluorescente microscopio, producendo immagini di alta qualità.
Micro-Manager (http://www.micro-manager.org), oltre ad essere gratuito, salva i file direttamente in formato tiff invece di formati di file proprietari di molti pacchetti software commerciali. Questo semplifica notevolmente le analisi dei nostri dati, eliminando la fase di conversione file necessario per leggere i file di immagine in ImageJ, Photoshop e altri software di editing delle immagini.
The authors have nothing to disclose.
Interno fondi istituzionali e le scienze biologiche Programma studiosi della University of Michigan sostenuto questo lavoro.
Olympus BX61 microscope with Hamamatsu Orca-ER camera. 10x Plan Fluorite (NA 0.3) and 60x PlanAchromat (NA 1.35) objective lenses
Micro-Manager 1.3.46(http://www.micro-manager.org)
Image J 1.43 (http://rsbweb.nih.gov/ij)
loci_tools.jar (http://www.loci.wisc.edu)
Agarose – molecular biology/gel electrophoresis grade
Fisher Superfrost/Plus Microscope Slides (Catalog # 12-550-15)
Laboratory tape (Fisher Catalog # 15-901 Series)
18 mm x 18 mm #1.5 Coverslips
M9 (242 mM KH2PO4, 40 mM Na2HPO4, 9 mM g NaCl, 19 mM NH4Cl MgSO4)
(http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm).
Egg Buffer (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 25 mM HEPES, pH 7.3)25.
Vaseline
Brush/Stick
Razor blades
Heat block
Dissecting microscope
Worms22
Platinum wire pick22
27G1/2 Precision Glide Needle (Beckton Dickinson) or a scalpel with a small blade