Summary

Ablation par laser à deux photons d’ostéoblastes chez des larves de poisson-zèbre en développement

Published: September 06, 2024
doi:

Summary

Ce protocole décrit une approche d’ablation laser à deux photons réalisée chez des larves de poisson-zèbre, qui sert de modèle pour étudier la régénération osseuse et les effets de la réponse immunitaire à l’ablation.

Abstract

Le poisson-zèbre (Danio rerio) a une capacité exceptionnelle à régénérer différents organes et appendices. La régénération osseuse chez le poisson-zèbre a été étudiée à l’aide de différentes méthodes telles que l’amputation des nageoires, l’épilation des écailles, la trépanation du crâne et les approches microscopiques. À l’aide d’une configuration de balayage laser confocal équipée d’un laser à deux photons, une méthode d’ablation laser a été développée comme paradigme de lésion pour ablater les cellules formant l’os (ostéoblastes) dans l’opercule en développement des larves de poisson-zèbre. La méthode décrite ici permet l’ablation des cellules de manière précise, car la surface, la forme et la profondeur peuvent être ajustées avec précision. De plus, cette méthode permet d’imager la zone avant et juste après l’ablation, de sorte que les effets à court terme de la blessure peuvent être analysés. Dans ce dispositif expérimental, la réponse immunitaire après ablation des ostéoblastes dans la zone lésée a été étudiée. Une augmentation du recrutement des macrophages a été observée après l’ablation, indiquant la pertinence de leur présence lors de la régénération osseuse.

Introduction

Le poisson-zèbre régénère divers organes tels que la rétine, le cerveau, le cœur et le pancréas1. De plus, le poisson-zèbre régénère les éléments squelettiques, c’est pourquoi il a été utilisé pour étudier la régénération des nageoires, des écailles et des calvaires (calottes crâniennes)2. Différents paradigmes expérimentaux ont été utilisés pour étudier la régénération tissulaire et osseuse, tels que la résection de la nageoire (amputation), la fracture de la nageoire, la trépanation du crâne 3,4, la cryolésion 5,6 ou l’ablation génétique 7,8,9. Récemment, les approches d’ablation au laser ont été largement utilisées chez le poisson-zèbre pour étudier la réponse de guérison et de régénération après une blessure 10,11,12,13,14.

L’ablation médiée par laser a été utilisée dans différents domaines de la recherche biologique, tels que la mécanobiologie, la biologie du développement, la recherche sur la régénération et la chirurgie tumorale 10,11,12,15,16,17,18,19. Il existe différentes méthodologies d’ablation laser, telles que l’utilisation de lasers YAG (yttrium et aluminium grenat), UV (ultraviolet) ou 2p (deux photons)20. L’ablation au laser permet d’enlever des cellules uniques ou de plus grandes portions de tissus de manière très précise, ce qui permet d’étudier différents processus, tels que la réponse du système immunitaire à l’ablation tumorale21 ou lors de la régénération de l’opercule du poisson-zèbre. Dans ce dernier exemple, l’ablation a été confirmée par la disparition du signal fluorophore nucléaire et cytoplasmique et la coloration de la nécrose10,22.

Il est bien connu que la réponse immunitaire innée et sa cinétique régulée sont essentielles à une régénération tissulaire appropriée. Les neutrophiles et les macrophages sont les premières cellules à être recrutées sur le site de la lésion, où ils jouent différents rôles, tels que la libération de cytokines et de facteurs de croissance, l’élimination des débris cellulaires et le remodelage de la matrice extracellulaire23. Ce recrutement et la fonctionnalisation ultérieure des macrophages ont également été observés chez les nageoires de poisson-zèbreamputées 24 et l’opercule en développement, qui a été soumis à une « nanodissection » laser conduisant à l’ablation des ostéoblastes10. Dans cette dernière expérience, la récupération du nombre d’ostéoblastes, le développement normal de l’opercule et le recrutement de cellules immunitaires innées (neutrophiles, macrophages et cellules de type ostéoclaste) dans la zone blessée ont été observés après une ablation par laser UV et par laser à deux photons10. Des expériences chez le poisson-zèbre dans lesquelles le système immunitaire a été pharmacologiquement supprimé par l’utilisation de glucocorticoïdes ont montré une altération de la régénération en cas d’immunité mal régulée, soutenant le rôle fonctionnel du système immunitaire dans la réparation des tissus 3,10,25,26.

Ici, une méthodologie d’ablation par laser à deux photons pour étudier la biologie de la régénération osseuse dans les os de poisson-zèbre en développement est décrite. En particulier, l’effet de l’approche d’ablation des ostéoblastes dans l’opercule est montré en termes de réponse immunitaire, qui est étudiée en surveillant le recrutement des macrophages sur le site d’ablation.

Protocol

Le protocole d’étude a reçu l’approbation de la Landesdirektion Sachsen, numéros de permis 25-5131/564/2, DD25-5131/450/4, 25-5131/496/56, DD25.1-5131/354/87. Les souches de poisson-zèbre utilisées ont été maintenues conformément à la législation nationale et dans des conditions normalisées comme décrit précédemment27,28. Les détails de tous les réactifs et de l’équipement utilisés dans l’étude sont ré…

Representative Results

L’ablation au laser a été effectuée comme indiqué dans le protocole ci-dessus. Le signal GFP des ostéoblastes dans la zone ablée a disparu instantanément après l’ablation. Pour étudier la réponse de l’ablation des ostéoblastes en termes de réponse immunitaire, la présence de macrophages chez les larves de 6 dpf avant et à 6 hpl a été imagée. Avant l’ablation, très peu de macrophages ont été observés dans la zone de l’opercule10 (<str…

Discussion

L’ablation au laser a été appliquée dans diverses disciplines de la recherche biologique. En particulier, il a été utile comme méthode pour étudier la régénération tissulaire 10,11,12. Par exemple, le recrutement et les changements phénotypiques des cellules immunitaires innées ont récemment été analysés au fil du temps à l’aide d’un laser UV ou de tests d’ablation laser…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par la Fondation allemande pour la recherche (DFG) Transregio 67 (projet 387653785), la DFG SPP 2084 μBone (projet KN 1102/2-1) à FK. Ce travail a été soutenu par l’installation de microscopie optique (projet DFG 413875620), une installation centrale de la plate-forme technologique CMCB à l’Université technique de Dresde. Les travaux de l’université technique de Dresde ont été cofinancés par des recettes fiscales basées sur le budget approuvé par le Parlement saxon (Landtag).

Materials

Calcium chloride dihydrate, CaCl2·H2O Carl Roth 5239.1
Cell Culture Dish, PS, 100/20 mm Greiner Bio-one 664160
Dumont #55 Foceps FST 11295-51 Tip shape straight, 11 cm, 0.05 x 0.02 mm
Falcon 6-well plate Corning 353502
Glass-bottom microwell dish MatTek P35G-1.5-14-C 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm Glass Diameter, Uncoated
Insight X3 multiphoton laser Spectra-Physics
Leica Application Suite LAS X, Leica Microsystems
Low melting agarose  Biozyme 840101 Biozym Plaque Agarose
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4·7H2O Sigma-Aldrich M5921
Mating cages many varieties, e.g. Tecniplast
Methyleneblue Carl Roth A514.1
MS-222 SIGMA Aldrich A5040
Potassium Chloride, KCl PanReac AppliChem 131494
Sodium chloride, NaCl Carl Roth 3957.1
SP8 FALCON  Leica Microsystems Equipped with a Insight X3 multiphoton laser and Leica Application Suite software
Stainless Steel Dissect Needle Bochem 12010 140 mm
Stereo Microscope System SZX16 Olympus Equipped with a LED illumination base SZX2-ILLTQ
Thermostatic Cabinets TS – WTW xylem TS 608/2-i For incubation (embryo)
Transfer pipette, 3.5 mL SARSTEDT 861171 155 x 15 mm, LD-PE, transparent
Zeiss SteREO Discovery.V12 version 4.7.1.0. Zeiss Equipped with Axiocam MRm camera and AxioVision sofware

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Citer Cet Article
López-Delgado, A. C., Knopf, F. Two-Photon Laser-Mediated Ablation of Osteoblasts in Developing Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (211), e67279, doi:10.3791/67279 (2024).

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