概要

ゼブラフィッシュ幼生の発育中の骨芽細胞の2光子レーザー媒介アブレーション

Published: September 06, 2024
doi:

概要

このプロトコルは、ゼブラフィッシュの幼生で実施される 2 光子レーザー アブレーション アプローチについて説明しており、骨再生とアブレーションに対する免疫応答の影響を研究するためのモデルとして機能します。

Abstract

ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、さまざまな臓器や付属肢を再生する優れた能力を持っています。ゼブラフィッシュの骨再生は、ヒレ切断、鱗摘採、頭蓋骨穿孔、顕微鏡的アプローチなど、さまざまな方法を用いて研究されてきました。2光子レーザーを搭載した共焦点レーザースキャニング装置を用いて、ゼブラフィッシュ幼生の発育中の骨形成細胞(骨芽細胞)をアブレーションする病変パラダイムとしてレーザーアブレーション法を開発しました。ここで説明する方法は、面積、形状、および深さを微調整できるため、正確な方法で細胞を切除することを可能にする。さらに、この方法では、アブレーションの前後の領域を画像化できるため、損傷の短期的な影響を分析できます。この実験装置では、損傷した領域の骨芽細胞のアブレーション後の免疫応答が研究されました。アブレーション後にマクロファージの動員の増加が観察され、骨再生中のマクロファージの存在の関連性が示されました。

Introduction

ゼブラフィッシュは、網膜、脳、心臓、膵臓など多様な臓器を再生します1。さらに、ゼブラフィッシュは骨格要素を再生するため、ヒレ、鱗、カルバリア(頭蓋骨)の再生の研究に利用されてきました2。組織および骨の再生を研究するために、ひれ切除術(切断)、ひれ骨折、頭蓋骨穿孔3,4、凍結損傷5,6、または遺伝的切除7,8,9など、さまざまな実験パラダイムが使用されてきました。最近、レーザーアブレーションアプローチは、損傷後の治癒および再生応答を研究するためにゼブラフィッシュで広く使用されています10,11,12,13,14。

レーザー媒介アブレーションは、機械生物学、発生生物学、再生研究、腫瘍手術など、生物学的研究のさまざまな分野で使用されてきました10,11,12,15,16,17,18,19。レーザーアブレーションには、YAG(イットリウムアルミニウムガーネット)、UV(紫外線)、または2p(2光子)レーザー20を使用するなど、さまざまな方法論があります。レーザーアブレーションは、単一細胞または組織のより大きな部分を非常に正確な方法で除去することを可能にし、腫瘍アブレーション21に対する免疫系の応答やゼブラフィッシュの蓋再生中のさまざまなプロセスの研究を可能にする。後者の例では、アブレーションは、核および細胞質の蛍光色素シグナルの消失および壊死染色10,22によって確認された。

自然免疫応答とその制御された動態が適切な組織再生に不可欠であることはよく知られています。好中球とマクロファージは、損傷部位に動員される最初の細胞であり、サイトカインと成長因子の放出、細胞破片の除去、細胞外マトリックスのリモデリングなど、さまざまな役割を果たします23。この動員とその後のマクロファージの機能化は、切断されたゼブラフィッシュのヒレ24と、骨芽細胞アブレーション10につながるレーザー「ナノダイセクション」にかけられた発達中のオペクルでも観察されています。後者の実験では、UVレーザーと2光子レーザーを介したアブレーション10の後、骨芽細胞数の回復、正常な蓋形成、および損傷部位への自然免疫細胞(好中球、マクロファージ、破骨細胞様細胞)の動員が観察された。ゼブラフィッシュで、グルココルチコイドを用いて免疫系を薬理学的に抑制した実験では、免疫の誤調節による再生の障害が示され、組織修復における免疫系の機能的役割が支持された3,10,25,26。

ここでは、ゼブラフィッシュの骨の発達における骨再生の生物学を研究するための2光子レーザー媒介アブレーション法について説明します。特に、オペクルにおける骨芽細胞アブレーションアプローチの効果は、免疫応答の観点から示されており、これはアブレーション部位へのマクロファージの動員を監視することによって調査されます。

Protocol

この研究プロトコルは、Landesdirektion Sachsenから承認を受けました。許可番号は25-5131/564/2、DD25-5131/450/4、25-5131/496/56、DD25.1-5131/354/87です。使用されたゼブラフィッシュの系統は、国内法に従って、前述の27,28の標準化された条件下で維持されました。本試験で使用したすべての試薬および機器の詳細は、材料表に?…

Representative Results

レーザーアブレーションは、上記のプロトコルに示されているように実施されました。アブレーション領域の骨芽細胞のGFP信号は、アブレーション後すぐに消失した。骨芽細胞アブレーションの応答を免疫応答の観点から研究するために、6 dpl前と6 hplでの6 dpf幼虫のマクロファージの存在を画像化しました。アブレーション前は、オペラクル領域10 …

Discussion

レーザーアブレーションは、生物学研究のさまざまな分野で応用されてきました。特に、組織再生を研究する方法として有用であった10,11,12。例えば、自然免疫細胞の動員および表現型の変化は、最近、UVレーザーまたは2光子レーザーアブレーションアッセイを用いて経時的に解析され、レーザー…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、ドイツ研究財団(DFG)のTransregio 67(プロジェクト387653785)、DFG SPP 2084μBone(プロジェクトKN 1102/2-1)からFKへの支援を受けました。この研究は、ドレスデン工科大学のCMCBテクノロジープラットフォームの中核施設である光学顕微鏡施設(DFGプロジェクト413875620)の支援を受けました。ドレスデン工科大学での作業は、ザクセン議会(Landtag)が合意した予算に基づいて税収と共同で賄われました。

Materials

Calcium chloride dihydrate, CaCl2·H2O Carl Roth 5239.1
Cell Culture Dish, PS, 100/20 mm Greiner Bio-one 664160
Dumont #55 Foceps FST 11295-51 Tip shape straight, 11 cm, 0.05 x 0.02 mm
Falcon 6-well plate Corning 353502
Glass-bottom microwell dish MatTek P35G-1.5-14-C 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm Glass Diameter, Uncoated
Insight X3 multiphoton laser Spectra-Physics
Leica Application Suite LAS X, Leica Microsystems
Low melting agarose  Biozyme 840101 Biozym Plaque Agarose
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4·7H2O Sigma-Aldrich M5921
Mating cages many varieties, e.g. Tecniplast
Methyleneblue Carl Roth A514.1
MS-222 SIGMA Aldrich A5040
Potassium Chloride, KCl PanReac AppliChem 131494
Sodium chloride, NaCl Carl Roth 3957.1
SP8 FALCON  Leica Microsystems Equipped with a Insight X3 multiphoton laser and Leica Application Suite software
Stainless Steel Dissect Needle Bochem 12010 140 mm
Stereo Microscope System SZX16 Olympus Equipped with a LED illumination base SZX2-ILLTQ
Thermostatic Cabinets TS – WTW xylem TS 608/2-i For incubation (embryo)
Transfer pipette, 3.5 mL SARSTEDT 861171 155 x 15 mm, LD-PE, transparent
Zeiss SteREO Discovery.V12 version 4.7.1.0. Zeiss Equipped with Axiocam MRm camera and AxioVision sofware

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記事を引用
López-Delgado, A. C., Knopf, F. Two-Photon Laser-Mediated Ablation of Osteoblasts in Developing Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (211), e67279, doi:10.3791/67279 (2024).

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