Purification et caractérisation biophysique de la myosine-7a humaine basée sur le système MultiBac

Les myosines sont des protéines motrices moléculaires qui interagissent avec l’actine pour piloter de nombreux processus cellulaires 1,2,3,4. L’homme possède 12 classes et 39 gènes de la myosine⁵, qui sont impliqués dans un large éventail de fonctions physiologiques, telles que la contraction musculaire⁶ et les processus sensoriels⁷. Chaque molécule de myosine est un complexe multimérique composé d’une chaîne lourde et de chaînes légères. La chaîne lourde est divisée en régions de la tête, du cou et de la queue. La tête contient des sites de liaison à l’actine et aux nucléotides qui sont responsables de l’hydrolyse de l’ATP et de la génération de la force sur les filaments d’actine². Le col est formé de plusieurs motifs IQ α-hélicoïdaux où un ensemble spécifique de chaînes lumineuses sont liés. Ensemble, ils fonctionnent comme un bras de levier pour amplifier les changements conformationnels du moteur en grands mouvements ^8,9,10. La queue contient des sous-domaines spécifiques à une classe et joue un rôle régulateur dans l’ajustement de l’activité motrice de la myosine et la médiation des interactions avec les partenaires de liaison cellulaire ^2,11.

La myosine humaine 7a, membre des myosines de classe 7, est essentielle aux processus auditifs et visuels^12,13. Les motifs IQ de la myosine-7a humaine sont associés à une combinaison unique de chaînes légères, y compris la chaîne légère régulatrice (RLC), la calmoduline et la protéine 4 de type calmoduline (CALML4)14,15,16. En plus de stabiliser le bras de levier, ces chaînes légères régulent les propriétés mécaniques de la myosine-7a en réponse à la signalisation calcique, une caractéristique qui semble être unique à l’isoforme¹⁴ des mammifères.

Des défauts dans le gène codant pour la chaîne lourde de la myosine-7a (MYO7A/USH1B) sont responsables du syndrome d’Usher de type 1, la forme la plus grave de perte combinée de la vision et de l’ouïe chez l’homme¹⁷. De plus, le gène de la chaîne légère CALML4 fait partie des gènes candidats cartographiés pour contenir l’allèle causal de l’USH1H, une autre variante du syndrome d’Usher de type 1^15,18. Dans la rétine, la myosine-7a est exprimée dans l’épithélium pigmentaire rétinien et les cellules photoréceptrices¹³. Il a été impliqué dans la localisation des mélanosomes dans l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR)¹⁹ et la phagocytose des disques du segment externe des photorécepteurs par les cellules EPR²⁰. Dans l’oreille interne, la myosine-7a se trouve principalement dans les stéréocils, où elle joue un rôle essentiel dans l’établissement des faisceaux de cheveux et dans le déclenchement du processus de transduction mécano-électrique 12,21,22^.

Si l’importance de la myosine-7a dans les cellules sensorielles est bien établie, ses mécanismes fonctionnels au niveau moléculaire restent mal compris. Cette lacune dans les connaissances est en partie due aux défis liés à la purification de la protéine intacte, en particulier de l’isoforme de mammifère. Récemment, des progrès significatifs ont été réalisés en utilisant le système MultiBac pour exprimer de manière recombinante l’holoenzyme¹⁴ complète de la myosine humaine 7a. Cette avancée a permis des caractérisations structurales et biophysiques de cette protéine motrice, conduisant à la découverte de plusieurs propriétés uniques de la myosine-7a humaine qui sont spécifiquement adaptées aux fonctions auditives des mammifères^14,23.

Le système MultiBac est une plate-forme avancée de cellules de baculovirus/insectes spécialement conçue pour l’expression de complexes multimériques eucaryotes^24,25. Une caractéristique clé de ce système est sa capacité à héberger plusieurs cassettes d’expression génique, chacune codant pour une sous-unité du complexe, au sein d’un seul baculovirus MultiBac. L’assemblage des cassettes d’expression multigénique est facilité par un module dit de multiplication : un site d’endonucléase à tête chercheuse (HE) et un site BstXI conçu par correspondance flanquant les sites de clonage multiple (MCS). Ce module permet l’assemblage itératif d’une cassette d’expression unique par restriction/ligature, en tirant parti du fait que les sites de restriction HE et BstXI sont éliminés lors de leur ligature. Dans cet article, la chaîne lourde de la myosine-7a humaine, la RLC, la calmoduline et le CALML4 sont chacun clonés dans le module de multiplication du vecteur pACEBac1 (Figure 1A), qui sont ensuite assemblés en une cassette d’expression multigénique par le processus itératif (Figure 1B). La cassette multigénique de la myosine-7a est intégrée dans le génome du baculovirus (bacmid) par la transposition de l’élément mini-Tn7 du vecteur pACEBac1 vers le site cible de la mini-attTn7 dans le génome (Figure 1C). Suivant les procédures de purification du bacmid, de production et d’amplification du baculovirus (figures 1D, E), le baculovirus recombinant myosine-7a MultiBac est préparé et peut être utilisé pour la production de protéines à grande échelle (figure 1F). De plus, les chaînes légères de myosine-7a peuvent être produites séparément chez E. coli et purifiées à l’aide d’une étiquette His6-SUMO clivable 26,27,28. Les chaînes légères purifiées sont utiles pour étudier leur dynamique de liaison et la régulation de la myosine-7a.

La protéine myosine-7a purifiée peut être soumise à des études structurales, biochimiques et biophysiques pour mieux comprendre la régulation structurelle-fonctionnelle de cette protéine motrice. De plus, ses interactions avec le réseau d’actine et d’autres protéines de liaison²⁹ peuvent être examinées à l’aide de diverses approches de reconstitution in vitro. Les résultats de ces analyses éclaireront les propriétés biophysiques de cette myosine, conduisant à une compréhension mécaniste de la façon dont la myosine-7a entraîne les changements cytosquelettiques et, en fin de compte, façonne la morphologie et la fonction uniques des cellules sensorielles. Dans cet article, nous détaillons un flux de travail pour le test de glissement des filaments d’actine qui a été spécifiquement adapté à la myosine-7a de mammifère. Le test de glissement des filaments d’actine est un test de motilité in vitro robuste qui étudie quantitativement le mouvement des filaments d’actine fluorescents propulsés par un grand nombre de moteurs de myosine immobilisés sur une surface de lamelle 30,31,32. Les avantages de ce test comprennent sa simplicité d’installation, ses exigences minimales en matière d’équipement (un microscope à fluorescence à grand champ équipé d’un appareil photo numérique) et sa grande reproductibilité. De plus, comme le mouvement des filaments d’actine est entraîné par un groupe de moteurs de myosine immobilisés, ce test est particulièrement utile pour étudier la motilité des myosines monomères telles que la myosine-7a^14,33. Les protocoles comprennent plusieurs modifications, allant des procédures expérimentales à l’analyse d’imagerie, spécifiquement adaptées aux propriétés mobiles uniques de la myosine-7a de mammifère. Grâce à la disponibilité de la protéine myosine-7a intacte et au protocole de caractérisation fonctionnelle décrit ici, cet article jette les bases d’une étude plus approfondie des rôles moléculaires de la myosine-7a dans les processus physiologiques et pathologiques.