Transformação mitocondrial em Baker

A levedura Saccharomyces cerevisiae é um modelo amplamente reconhecido usado para estudar a biogênese mitocondrial. Como a levedura é um organismo anaeróbico e facultativo, é possível estudar extensivamente as causas e consequências da introdução de mutações que prejudicam a respiração. Além disso, este organismo possui ferramentas genéticas e bioquímicas amigáveis para estudar as vias mitocondriais. No entanto, um dos recursos mais poderosos para explorar os mecanismos de montagem de complexos respiratórios e síntese de proteínas mitocondriais é a capacidade de transformar as mitocôndrias e modificar o genoma da organela. Anteriormente, foi útil introduzir no DNA mitocondrial (mtDNA) mutações pontuais ou pequenas deleções / inserções ^1,2,3,4,5, excluir genes ^6,7, fazer rearranjos gênicos ^7,8, adicionar epítopos às proteínas mitocondriais ^9,10, realocar genes do núcleo para a mitocôndria^11,12, e introduzir genes repórter como BarStar¹³, GFP^14,15, luciferase¹⁶ e o ARG8^m17,18 mais amplamente utilizado. As modificações do genoma mitocondrial nos permitiram dissecar e identificar mecanismos que, de outra forma, seriam difíceis de compreender. Por exemplo, o gene repórter ^{ARG8 m} inserido no locus COX1 no DNA mitocondrial foi crucial para entender que o Mss51 tem um papel duplo na biogênese de Cox1. Primeiro, é um ativador translacional do mRNA de COX1 e, segundo, é um acompanhante de montagem para^{a proteína} Cox1 ^7,19 recém-produzida. Este trabalho apresenta um método detalhado para transformar as mitocôndrias de S. cerevisiae. Embora o protocolo de transformação mitocondrial tenha sido publicado anteriormente 16,20,21,22,23, uma abordagem visual por meio de um vídeo é essencial para entender completamente as diferentes etapas e detalhes do método. O método consiste em várias etapas e é dividido em quatro etapas gerais:

Figura 1: Visão geral do procedimento de transformação mitocondrial por bombardeio de microprojéteis de alta velocidade: 1) As partículas de tungstênio são esterilizadas e preparadas antes do revestimento de DNA. 2) Dois plasmídeos diferentes são precipitados na superfície dos WPs. Um deles é um plasmídeo bacteriano contendo a construção que será direcionada para a matriz mitocondrial. O outro é um vetor de expressão de levedura nuclear que carrega um marcador de auxotrofia. 3) Uma cepa de levedura receptora sem DNA mitocondrial (rho⁰) é cultivada em uma fonte de carbono fermentativa como galactose ou rafinose, que não exerce nenhuma repressão de glicose da expressão gênica mitocondrial^34,35. A cultura é espalhada em placas de Petri contendo o meio de bombardeio. 4) WPs revestidos com plasmídeos são disparados para a cepa do receptor por bombardeio de microprojéteis de alta velocidade. 5^{) Colônias} de rho sintéticas positivas contendo o plasmídeo mitocondrial são selecionadas por acoplamento a uma cepa de teste. 6) A construção mitocondrial é integrada ao genoma mitocondrial no locus desejado, acasalando ^{a cepa} sintética (doador) com a cepa aceptora por um processo conhecido como citodção. 7) O receptor positivo, cepa haplóide que carrega a construção mitocondrial, é selecionado e purificado em diferentes meios. Abreviaturas: WPs = partículas de tungstênio; mtDNA = DNA mitocondrial. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Transformação de células com a construção de DNA destinada a se integrar ao genoma mitocondrial (Figura 1, etapas 1-4)
Embora seja possível transformar diretamente uma levedura contendo um genoma mitocondrial completo (rho ⁺), a transformação é 10-20 vezes mais eficiente se as células não tiverem DNA mitocondrial (rho⁰) ²⁴ . As partículas de tungstênio (WPs) são revestidas com dois plasmídeos diferentes que serão cotransformados. O primeiro é um vetor de expressão μ levedura 2 que carrega um marcador de auxotrofia, como LEU2 ou URA3 (por exemplo, YEp351 ou YEp352, respectivamente). Se a introdução biolística de DNA nas células de levedura for bem-sucedida, os transformantes crescerão no meio de auxotrofia (ou seja, um meio sem leucina ou uracila). Este plasmídeo é útil para fazer a primeira seleção das células que adquiriram o plasmídeo nuclear; caso contrário, o número de colônias resultantes saturaria a placa. O segundo plasmídeo é um plasmídeo bacteriano (como pBluescript ou similar) contendo a construção mitocondrial destinada a ser integrada ao genoma mitocondrial. A construção deve conter pelo menos 100 nt de sequências mitocondriais flanqueadoras de 5′ e 3′ para recombinação com a região mitocondrial de interesse. Em nossa experiência, sequências flanqueadoras maiores têm maior probabilidade de se recombinar com sucesso com o locus alvo no genoma mitocondrial.

Um exemplo específico é mostrado na Figura 2²⁵. Neste exemplo, o objetivo era excluir a região do gene mitocondrial COX1 que codifica os últimos 15 aminoácidos da proteína correspondente (Cox1ΔC15) (Figura 2A). O plasmídeo bacteriano portador da mutação COX1ΔC15 continha 395 nt e 990 nt das regiões 5 ‘e 3’ não traduzidas do gene, respectivamente. O plasmídeo foi derivado do pBluescript (pXPM61) e, juntamente com o plasmídeo de 2 μ YEp352, foram coprecipitados na superfície dos WPs (Figura 2B). Os WPs foram então introduzidos por bombardeio de microprojéteis na cepa receptora selecionada (Figura 2C). Esta cepa, denominada NAB69²⁶, é uma cepa MATa, rho⁰ com os alelos kar1-1 e ade2 (a importância dessas características é discutida abaixo). As células foram plaqueadas em meios de bombardeio sem uracila para selecionar aquelas que adquiriram o plasmídeo de 2 μ (Figura 2C). As células foram cultivadas por 5-7 noites a 30 °C.

Seleção das células que adquiriram o plasmídeo bacteriano contendo a construção mitocondrial e o plasmídeo nuclear 2 μ carregando o marcador de auxotrofia (Figura 1, etapa 5)
As colônias positivas manterão muitas cópias do plasmídeo bacteriano em suas mitocôndrias²². Como as células transformadas são originalmente rho⁰, nenhuma sequência mitocondrial suporta a tradução da construção mitocondrial presente no plasmídeo; portanto, o gene mitocondrial transformado não será expresso. É necessário acoplar os transformantes com uma cepa de teste para detectar as colônias de leveduras que adquiriram o plasmídeo mitocondrial. O genoma mitocondrial da cepa testadora contém uma versão mutada não funcional do gene de interesse. Após o acasalamento, as mitocôndrias se fundirão e a sequência mitocondrial incluída no plasmídeo transformado se recombinará com o gene mitocondrial mutado da cepa testadora; consequentemente, a recuperação do gene WT reconstituirá a função. O diplóide resultante terá um fenótipo positivo detectável (geralmente a capacidade de crescer em meio respiratório ou um meio sem arginina). As células positivas que carregam o plasmídeo bacteriano nas mitocôndrias são denominadas ^“células rho sintéticas”. No exemplo específico da Figura 2D^{, as células} rho sintéticas portadoras da construção COX1ΔC15 (denominadas XPM199) foram replicadas em um meio sem uracila (esta é a placa mestra da qual as colônias positivas foram purificadas). Eles também foram replicados em um gramado da cepa de teste L45²⁷, que contém a mutação não funcional cox1D369N. Após o acasalamento por duas noites, o genoma mitocondrial de L45 e XPM199 se recombinou, resultando em um gene COX1 funcional; portanto, os diplóides recuperaram a capacidade de crescer em meios respiratórios. Da placa mestra, escolhemos as colônias positivas. Eles foram listrados em placas sem uracila, e os testes seletivos foram repetidos para ^{obter células} rho sintéticas puras (Figura 2E). É importante notar que a placa de teste é apenas para a identificação ^{de colônias} de rho sintéticas, e os mutantes não podem ser recuperados dessas placas.

Integração da construção no genoma mitocondrial da cepa pretendida
Essa etapa é alcançada por um processo denominado citodução^28,29 (Figura 1, etapa 6). Nesta abordagem, ^{a cepa} sintética (cepa doadora) é acoplada à cepa receptora pretendida do tipo de acasalamento oposto. Um requisito essencial é que pelo menos uma das duas cepas de acasalamento carregue a mutação kar1-1 para impedir a fusão nuclear³⁰. Assim, o acasalamento das duas células produz um zigoto binucleado (Figura 3). A rede mitocondrial das células parentais (doador e aceitador) se funde e as moléculas de DNA mitocondrial se recombinam. Os zigotos binucleados são incubados/recuperados para permitir o brotamento, que produzirá células haplóides. Esses haplóides carregam o fundo nuclear de uma das células parentais. Da mesma forma, os haplóides podem transportar o DNA mitocondrial da célula parental ou do DNA mitocondrial recombinado de interesse. No entanto, a mutação kar1-1 não é 100% eficaz, e alguns diplóides verdadeiros serão formados durante o acasalamento^28,29. A cepa sintética de rho^– (doador, XPM199) carregava o alelo kar1-1 no exemplo. Como marcador seletivo, apresentava o alelo ade2, tornando-se um auxotrófico para adenina (Figura 4). A cepa aceptora foi XPM10, uma cepa rho⁺ com a construção cox1Δ::ARG8^m, onde o repórter ARG8^m substituiu os códons COX1 no genoma mitocondrial⁷. A mistura de ambas as culturas de células foi adicionada a uma placa YPD como uma gota para permitir o acasalamento. Após 3-5 h, as células foram observadas ao microscópio óptico para detectar a formação de shmoos (Figura 3B), uma forma celular associada ao acasalamento. Após o tempo de incubação/recuperação, os zigotos binucleares foram plaqueados em meio sem adenina para evitar o crescimento das células doadoras.

Seleção da cepa haploide que carrega o genoma mitocondrial de interesse (Figura 1, etapa 7)
Uma mistura de células doadoras, aceptoras e diplóides está presente após a citação. Portanto, após a incubação/recuperação dos zigotos binucleados, as células devem ser cultivadas em diferentes meios seletivos para identificar e purificar os haplóides de interesse. O meio seletivo depende dos genótipos do doador, das cepas aceitadoras e da construção mitocondrial pretendida. No entanto, em geral, o raciocínio para a escolha do meio seletivo é: i) após a incubação/recuperação, a mistura de citodução é cultivada em meio seletivo onde a cepa parental do doador não pode crescer. No exemplo específico da Figura 4A, B, o doador (cepa sintética de rho⁾ carrega o alelo ade2 não funcional. Assim, a mistura de citoducção deve ser incubada em uma placa média sem adenina. Esta é a placa mestra. ii) Uma vez que as colônias crescem, a placa mestra é replicada novamente em um meio sem adenina (para gerar uma nova placa mestra de onde as colônias positivas de interesse serão purificadas) e, em seguida, em um meio onde apenas diplóides podem crescer. Isso é necessário para evitar a purificação inadvertida de colônias diplóides. No caso do exemplo da Figura 4C, apenas diplóides podem crescer em meios sem leucina. iii) A placa mestra também é replicada em meios onde apenas os haploides aceitadores que incorporaram o DNA mitocondrial de interesse crescerão. No exemplo da Figura 4C, os haplóides crescem em meios respiratórios contendo etanol / glicerol como fonte de carbono, uma vez que a proteína Cox1ΔC15 é funcional. A cepa rho ⁺ resultante com o mtDNA de interesse foi denominada XPM209²⁵. As cepas usadas na Figura 2 e na Figura 4 estão listadas na Tabela 1.

Figura 2: Diagrama descrevendo um exemplo específico de transformação mitocondrial e seleção de células ^rho positivas. (A) A modificação pretendida do genoma mitocondrial foi uma deleção da região que codifica os últimos 15 aminoácidos da subunidade Cox1 (Cox1ΔC15). (B) Os WPs foram revestidos com dois plasmídeos para transformar células de levedura. Um foi o plasmídeo de 2 μ Yep352 que foi direcionado e expresso no núcleo. O outro foi o plasmídeo pXPM61, que contém o alelo COX1ΔC15 mais 395 nt e 990 nt dos COX1 5 ‘e 3’-UTRs, respectivamente. (C) Os WPs foram introduzidos em células da cepa NAB69, que não possui DNA mitocondrial (cepa rho⁰ ). As colônias transformantes obtidas das placas de bombardeio foram replicadas em um meio sem uracila, o marcador auxotrófico do plasmídeo nuclear YEp352. (D) Para selecionar ^{as colônias} rho positivas, a placa -URA foi replicada em um meio sem uracila. Esta foi a placa mestra da qual as colônias positivas foram colhidas e isoladas. Também foi replicado em placas com rich media (YPD) e um gramado de uma cepa de teste. Durante o acasalamento, o ^DNA mitocondrial sintético foi recombinado com o DNA mitocondrial da cepa testadora, L45²⁷, que carrega uma mutação no gene COX1 (D369N). Os diplóides que cresceram no meio respiratório continham o DNA transformado. As colônias correspondentes foram escolhidas da placa mestra para relistrar e purificar. Para ajudar a identificar as colônias positivas na placa mestra em todas as réplicas do revestimento, foram feitas marcas com um marcador permanente nas bordas das placas (linhas verdes). (E) As colônias positivas selecionadas foram resquentadas em um meio sem uracila. Esta foi a nova placa mestre. Como em D, mais duas rodadas de testes foram realizadas para purificar as colônias sintéticas de rho^. Abreviaturas: WPs = partículas de tungstênio; mtDNA = DNA mitocondrial; -URA/Sorb = sem uracila/ contendo Sorbitol; WT = tipo selvagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Diagrama descrevendo o procedimento de citodução. (A) Visão geral de como as células se acasalam durante a citação. Durante a citodção, as mitocôndrias das cepas doadora e receptora se fundem para que o DNA mitocondrial de ambas as cepas se recombine. Como a fusão nuclear é reduzida devido à mutação kar1-1 ³⁰, os zigotos binucleares são formados. Após algum tempo de incubação / recuperação, os brotos de zigotos binucleares e os aceptores haplóides contendo a mutação mitocondrial pretendida são selecionados. (B) O acasalamento ^{da cepa} sintética (doadora) e da cepa aceptora por meio da citoducção permite a formação de shmoos (setas vermelhas), uma forma característica da levedura de acasalamento. A imagem foi tirada em microscópio óptico com objetiva de 100x. Barra de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Diagrama descrevendo um exemplo específico de citoducção para integrar a mutação COX1ΔC15 no genoma mitocondrial. (A) Culturas líquidas ^{da cepa} rho sintética (doador, XPM199) e da cepa de interesse (aceptor, XPM10) foram misturadas para acasalar. Após a formação do shmoo, a mistura foi recuperada em uma cultura líquida por 2-4 h. Em seguida, a mistura de citoducção foi espalhada em uma placa com um meio sem adenina para evitar o crescimento das células doadoras. (B) Representação esquemática dos eventos de recombinação do DNA mitocondrial do doador (XPM199) e do aceptor (XPM10) durante a citação. (C) A placa mestra foi replicada em diferentes meios seletivos para identificar e purificar os haplóides que integraram o gene mitocondrial pretendido no DNA da organela (XPM209) ²⁵. Abreviaturas: -ADE = sem adenina; -LEU = falta de leucina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.