טרנספורמציה מיטוכונדריאלית בבייקר

שמרי Saccharomyces cerevisiae הם מודל מוכר המשמש לחקר ביוגנזה מיטוכונדריאלית. מכיוון ששמרים הם אורגניזם אנאירובי, פקולטטיבי, ניתן ללמוד בהרחבה את הסיבות וההשלכות של החדרת מוטציות הפוגעות בנשימה. בנוסף, אורגניזם זה בעל כלים גנטיים וביוכימיים ידידותיים לחקר מסלולים מיטוכונדריאליים. עם זאת, אחד המשאבים החזקים ביותר לחקור את מנגנוני הרכבת קומפלקס הנשימה וסינתזה של חלבון מיטוכונדריאלי הוא היכולת לשנות מיטוכונדריה ולשנות את הגנום של אברונים. בעבר, היה מועיל להכניס לדנ”א המיטוכונדריאלי (mtDNA) מוטציות נקודתיות או מחיקות/החדרות קטנות 1,2,3,4,5, למחוק גנים ^6,7, לבצע סידורים מחדש של גנים ^7,8, להוסיף אפיטופים לחלבונים מיטוכונדריאליים ^9,10, להעביר גנים מהגרעין למיטוכונדריה¹¹,¹², ולהציג גנים כתבים כמו BarStar¹³, GFP^14,15, luciferase¹⁶, ואת ARG8^m17,18 הנפוץ ביותר. שינויים בגנום המיטוכונדריאלי אפשרו לנו לנתח ולזהות מנגנונים שאחרת היו קשים להבנה. לדוגמה, הגן ARG8^m reporter שהוחדר למוקד COX1 בדנ”א המיטוכונדריאלי היה חיוני להבנה של-Mss51 יש תפקיד כפול בביוגנזה של Cox1. ראשית, הוא מפעיל תרגום של ה-mRNA COX1, ושנית, הוא מלווה הרכבה^{של חלבון} Cox1 החדש ^7,19. עבודה זו מציגה שיטה מפורטת לשינוי מיטוכונדריה של S. cerevisiae. למרות שפרוטוקול השינוי המיטוכונדריאלי פורסם מוקדם יותר 16,20,21,22,23, גישה חזותית באמצעות וידאו חיונית כדי להבין ביסודיות את השלבים והפרטים השונים של השיטה. השיטה מורכבת משלבים שונים ומחולקת לארבעה שלבים כלליים:

איור 1: סקירה כללית של תהליך הטרנספורמציה של המיטוכונדריה על-ידי הפצצת מיקרו-קליע במהירות גבוהה: 1) חלקיקי הטונגסטן מעוקרים ומוכנים לפני ציפוי הדנ”א. 2) שני פלסמידים שונים מואצים על פני השטח של WPs. האחד הוא פלסמיד חיידקי המכיל את המבנה שיופנה למטריצה המיטוכונדריאלית. השני הוא וקטור ביטוי שמרים גרעיניים הנושא סמן אוקסוטרופיה. 3) זן שמרים קולטני חסר DNA מיטוכונדריאלי (rho⁰) גדל על מקור פחמן מותסס כמו גלקטוז או רפינוז, אשר אינו מפעיל כל דיכוי גלוקוז של ביטוי גנים מיטוכונדריאליים^34,35. התרבות מתפשטת על צלחות פטרי המכילות את אמצעי ההפצצה. 4) WPs המצופים בפלסמידים נורים לזן הקולטן על ידי הפצצת מיקרו-קליע במהירות גבוהה. 5^{) מושבות} רו סינתטיות חיוביות המכילות את הפלסמיד המיטוכונדריאלי נבחרות על ידי הזדווגות לזן בודק. 6) המבנה המיטוכונדריאלי משולב בגנום המיטוכונדריאלי במקום הרצוי על ידי זיווג ^{זן הרו} הסינתטי (תורם) עם הזן המקבל בתהליך המכונה ציטודוקציה. 7) הקולטן החיובי, הזן הפלואידי הנושא את המבנה המיטוכונדריאלי נבחר ומטוהר במדיות שונות. קיצורים: WPs = חלקיקי טונגסטן; mtDNA = DNA מיטוכונדריאלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טרנספורמציה של תאים עם מבנה דנ”א שנועד להשתלב בגנום המיטוכונדריאלי (איור 1, שלבים 1-4)
למרות שניתן לשנות ישירות שמרים המכילים גנום מיטוכונדריאלי שלם (rho⁺), השינוי יעיל פי 10-20 אם התאים חסרים DNA מיטוכונדריאלי (rho⁰)²⁴. חלקיקי טונגסטן (WPs) מצופים בשני פלסמידים שונים שיומרו במשותף. הראשון הוא וקטור ביטוי שמרים 2 μ הנושא סמן אוקסוטרופי, כגון LEU2 או URA3 (למשל, YEp351 או YEp352, בהתאמה). אם ההחדרה הביוליסטית של דנ”א לתאי השמרים מוצלחת, הטרנספורמנטים יגדלו על מדיום האוקסוטרופיה (כלומר, מדיום חסר לאוצין או אורציל). פלסמיד זה מועיל בביצוע הבחירה הראשונה של התאים שרכשו את הפלסמיד הגרעיני; אחרת, מספר המושבות שייווצרו ירווה את הצלחת. הפלסמיד השני הוא פלסמיד חיידקי (כגון pBluescript או דומה) המכיל את המבנה המיטוכונדריאלי המיועד להשתלב בגנום המיטוכונדריאלי. המבנה חייב להכיל לפחות 100 nt של רצפים מיטוכונדריאליים של 5′ ו-3′ עבור רקומבינציה עם האזור המיטוכונדריאלי המעניין. מניסיוננו, רצפי איגוף גדולים יותר נוטים יותר להשתלב מחדש בהצלחה עם מוקד המטרה בגנום המיטוכונדריאלי.

דוגמה ספציפית מוצגת באיור 2²⁵. בדוגמה זו, המטרה הייתה למחוק את האזור של הגן COX1 במיטוכונדריה המקודד עבור 15 חומצות האמינו האחרונות של החלבון המתאים (Cox1ΔC15) (איור 2A). הפלסמיד החיידקי הנושא את המוטציה COX1ΔC15 הכיל 395 nt ו-990 nt מהאזורים הלא מתורגמים 5′ ו-3′ של הגן, בהתאמה. הפלסמיד נגזר מ-pBluescript (pXPM61), ויחד עם 2 μ פלסמיד YEp352, הם קואצו על פני השטח של WPs (איור 2B). לאחר מכן הוכנסו ה-WPs באמצעות הפצצת מיקרו-קליעים לתוך הזן המקבל שנבחר (איור 2C). זן זה, הנקרא NAB69²⁶, הוא זן MATa, rho⁰ הנושא את האללים kar1-1 ו – ade2 (חשיבותם של מאפיינים אלה תידון להלן). התאים היו מצופים על אמצעי הפצצה חסרי אורציל כדי לבחור את אלה שרכשו את 2 μ פלסמיד (איור 2C). תאים גודלו במשך 5-7 לילות ב 30 מעלות צלזיוס.

בחירת התאים שרכשו את פלסמיד החיידקים המכיל את המבנה המיטוכונדריאלי ואת פלסמיד הגרעין 2 μ הנושא את סמן האוקסוטרופיה (איור 1, שלב 5)
המושבות החיוביות ישמרו עותקים רבים של פלסמיד החיידקים במיטוכונדריה²² שלהן. מאחר שהתאים שעברו טרנספורמציה הם במקור rho⁰, אין רצפים מיטוכונדריאליים התומכים בתרגום המבנה המיטוכונדריאלי הקיים בפלסמיד; לפיכך, הגן המיטוכונדריאלי שעבר טרנספורמציה לא יבוא לידי ביטוי. יש צורך להזדווג עם טרנספורמטים עם זן בודק כדי לזהות את מושבות השמרים שרכשו את פלסמיד המיטוכונדריה. הגנום המיטוכונדריאלי של זן הבודק מכיל גרסה מוטנטית לא מתפקדת של הגן המעניין. לאחר ההזדווגות, המיטוכונדריה יתמזגו, והרצף המיטוכונדריאלי הכלול בפלסמיד שעבר טרנספורמציה יתמזג מחדש עם הגן המיטוכונדריאלי שעבר מוטציה מזן הבודק; כתוצאה מכך, ההתאוששות של הגן WT תחזור לתפקד. הדיפלואיד המתקבל יהיה בעל פנוטיפ חיובי הניתן לזיהוי (בדרך כלל היכולת לגדול בתווך נשימתי או בתווך חסר ארגינין). התאים החיוביים הנושאים את פלסמיד החיידקים במיטוכונדריה נקראים ^{“תאי רו} סינתטיים”. בדוגמה הספציפית של איור 2D^{, תאי רו} סינתטיים שנשאו את מבנה COX1ΔC15 (שנקרא XPM199) צופו מחדש על תווך חסר אורציל (זהו לוח האב שממנו טוהרו מושבות חיוביות). הם גם צופו בהעתק על מדשאה מזן בודק L45²⁷, המכיל את המוטציה הלא פונקציונלית cox1D369N. לאחר הזדווגות של שני לילות, הגנום המיטוכונדריאלי של L45 ו-XPM199 התאחד מחדש, והתוצאה הייתה גן COX1 פונקציונלי; לכן, הדיפלואידים השיבו לעצמם את היכולת לגדול על אמצעי הנשימה. מצלחת המאסטר בחרנו את המושבות החיוביות. הם היו מפוספסים על לוחות חסרי אורציל, והבדיקות הסלקטיביות חזרו על עצמן כדי ^{לקבל תאי רו} סינתטיים טהורים (איור 2E). חשוב לציין כי לוחית הבדיקה מיועדת רק לזיהוי ^מושבות רו סינתטיות, ולא ניתן לשחזר מוטנטים מלוחות אלה.

שילוב המבנה בגנום המיטוכונדריאלי של הזן המיועד
שלב זה מושג על-ידי תהליך שנקרא ציטודוקציה^28,29 (איור 1, שלב 6). בגישה זו^{, זן הרו} הסינתטי (זן תורם) מזווג לזן המקבל המיועד מסוג ההזדווגות הנגדי. דרישה חיונית היא שלפחות אחד משני זני ההזדווגות יישא את מוטציית kar1-1 כדי לעכב היתוך גרעיני³⁰. לפיכך, הזדווגות של שני התאים מייצרת זיגוטה דו-עינית (איור 3). הרשת המיטוכונדריאלית מתאי ההורים (תורם ומקבל) מתמזגת ומולקולות הדנ”א המיטוכונדריאלי משתלבות מחדש. הזיגוטה הדו-עינית מודגרת/משוחזרת כדי לאפשר ניצנים, אשר ייצרו תאים הפלואידים. הפלואידים האלה נושאים את הרקע הגרעיני של אחד מתאי ההורים. באופן דומה, הפלואידים יכולים לשאת את הדנ”א המיטוכונדריאלי מתא ההורים או מהדנ”א המיטוכונדריאלי המשולב מחדש. עם זאת, מוטציית kar1-1 אינה יעילה ב-100%, וכמה דיפלואידים אמיתיים ייווצרו במהלך ההזדווגות^28,29. ^{זן הרו} הסינתטי (תורם, XPM199) נשא את האלל kar1-1 בדוגמה. כסמן סלקטיבי, היה לו אלל ade2, מה שהופך אותו לאוקסוטרופ עבור אדנין (איור 4). הזן המקבל היה XPM10, זן rho⁺ הנושא את המבנה cox1Δ::ARG8^m, שבו הכתב ARG8^m החליף את קודוני COX1 בגנום המיטוכונדריאלי⁷. התערובת של שתי תרביות התאים נוספה לצלחת YPD כטיפה כדי לאפשר הזדווגות. לאחר 3-5 שעות, התאים נצפו תחת מיקרוסקופ אור כדי לזהות היווצרות של שמוס (איור 3B), צורת תא שקשורה להזדווגות. לאחר זמן הדגירה/התאוששות, הזיגוטה הדו-גרעינית צופתה על תווך חסר אדנין כדי למנוע את צמיחת תאי התורם.

בחירת הזן הפלואידי הנושא את הגנום המיטוכונדריאלי המעניין (איור 1, שלב 7)
תערובת של תאים תורמים, מקבלים ודיפלואידים קיימת לאחר ציטודוקציה. לכן, לאחר הדגירה/התאוששות של הזיגוטה הדו-מינית, יש לגדל תאים במדיות סלקטיביות שונות כדי לזהות ולטהר את הפלואידים המעניינים. המדיה הסלקטיבית תלויה בגנוטיפים של התורם, בזנים המקבלים ובמבנה המיטוכונדריאלי המיועד. עם זאת, באופן כללי, הנימוקים לבחירת המדיה הסלקטיבית הם: i) לאחר הדגירה/התאוששות, תערובת הציטודוקציה גדלה על מדיום סלקטיבי שבו הזן ההורי התורם אינו יכול לגדול. בדוגמה הספציפית באיור 4A,B, התורם (^{זן רו} סינתטי) נושא את אלל ade2 הלא פונקציונלי. לכן, תערובת cytoduction חייב להיות מודגר על צלחת בינונית חסר אדנין. זוהי צלחת המאסטר. ב) ברגע שהמושבות גדלות, צלחת המאסטר משוכפלת שוב על מדיום חסר אדנין (כדי ליצור צלחת מאסטר חדשה שממנה יטוהרו המושבות החיוביות המעניינות), ולאחר מכן, על מדיום שבו רק דיפלואידים יכולים לצמוח. זה הכרחי כדי למנוע טיהור נוסף בשוגג של מושבות דיפלואידיות. במקרה של הדוגמה מאיור 4C, רק דיפלואידים יכולים לגדול על מדיה חסרת לאוצין. iii) צלחת האב משוכפלת גם על מדיה שבה רק אותם הפלואידים המקבלים ששילבו את הדנ”א המיטוכונדריאלי של עניין יגדלו. בדוגמה של איור 4C, הפלואידים גדלים על מצע נשימתי המכיל אתנול/גליצרול כמקור פחמן, מאחר שהחלבון Cox1ΔC15 הוא פונקציונלי. זן rho⁺ שנוצר הנושא את mtDNA של עניין נקרא XPM209²⁵. הזנים שבהם נעשה שימוש באיור 2 ובאיור 4 מפורטים בטבלה 1.

איור 2: דיאגרמה המתארת דוגמה ספציפית של טרנספורמציה מיטוכונדריאלית ובחירה של תאי רו חיוביים. (A) השינוי המיועד של הגנום המיטוכונדריאלי היה מחיקה של האזור המקודד עבור 15 חומצות האמינו האחרונות של תת-היחידה Cox1 (Cox1ΔC15). (B) WPs צופו בשני פלסמידים כדי להפוך תאי שמרים. אחד מהם היה 2 μ פלסמיד Yep352 שכוון ובא לידי ביטוי בגרעין. השני היה פלסמיד pXPM61, המכיל את אלל COX1ΔC15 בתוספת 395 nt ו-990 nt של COX1 5′ ו-3′-UTRs, בהתאמה. (C) WPs הוכנסו לתאים מהזן NAB69, אשר חסר DNA מיטוכונדריאלי (זן rho⁰). מושבות טרנספורמנטיות שהתקבלו מלוחות ההפצצה שוכפלו על תווך חסר אורציל, הסמן האוקסוטרופי של הפלסמיד הגרעיני YEp352. (D) כדי לבחור את מושבות הרו החיוביות, לוחית ה-URA שוכפלה על מדיה חסרת אורציל. זו הייתה צלחת המאסטר שממנה נקטפו ובודדו המושבות החיוביות. הוא שוכפל גם על לוחות עם מדיה עשירה (YPD) ומדשאה של זן טסטר. במהלך ההזדווגות, הדנ”א ^{הרו-מיטוכונדריאלי} הסינתטי שולב מחדש עם הדנ”א המיטוכונדריאלי מזן הבודק, L45²⁷, הנושא מוטציה בגן COX1 (D369N). הדיפלואידים שגדלו על מצע הנשימה הכילו את הדנ”א שעבר טרנספורמציה. המושבות המקבילות נקטפו מצלחת המאסטר כדי לנוח ולטהר. כדי לסייע בזיהוי המושבות החיוביות בלוח האב לאורך כל ציפוי העתק, נעשו סימנים בטוש קבוע בשולי הלוחות (קווים ירוקים). (E) המושבות החיוביות שנבחרו הוחזרו על מדיום חסר אורציל. זו הייתה צלחת המאסטר החדשה. כמו ב-D, נערכו שני סבבי בדיקות נוספים לטיהור ^מושבות הרו הסינתטיות. קיצורים: WPs = חלקיקי טונגסטן; mtDNA = DNA מיטוכונדריאלי; -URA/Sorb = חסר אורציל/ המכיל סורביטול; WT = סוג פראי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: דיאגרמה המתארת את הליך הציטודוקציה. (A) סקירה כללית של האופן שבו תאים מזדווגים במהלך ציטודוקציה. במהלך הציטודוקציה, המיטוכונדריה מהזנים התורם והמקבל מתמזגים כך שהדנ”א המיטוכונדריאלי משני הזנים משתלב מחדש. מאז היתוך גרעיני מופחת עקב מוטציה kar1-1 ³⁰, זיגוטות דו גרעיניות נוצרים. לאחר זמן דגירה/התאוששות מסוים, נבחרים ניצני הזיגוטה הדו-גרעיניים וקולטי הפלואידים המכילים את המוטציה המיטוכונדריאלית המיועדת. (B) הזדווגות ^{של זן הרו} הסינתטי (תורם) והזן המקבל באמצעות ציטודוקציה מאפשרת היווצרות של שמואים (חיצים אדומים), צורה אופיינית של שמרי הזדווגות. התמונה צולמה תחת מיקרוסקופ אור עם מטרה של 100x. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: דיאגרמה המתארת דוגמה ספציפית של ציטודוקציה כדי לשלב את המוטציה COX1ΔC15 בגנום המיטוכונדריאלי. (A) תרביות נוזליות ^{של זן הרו} הסינתטי (תורם, XPM199) והזן המעניין (מקבל, XPM10) עורבבו כדי להזדווג. לאחר היווצרות שמו, התערובת נמצאה בתרבית נוזלית במשך 2-4 שעות. לאחר מכן, תערובת הציטודוקציה נמרחה על צלחת עם מדיום חסר אדנין כדי למנוע את צמיחת התאים התורמים. (B) ייצוג סכמטי של אירועי הרקומבינציה של הדנ”א המיטוכונדריאלי מהתורם (XPM199) ומהמקבל (XPM10) במהלך הציטודוקציה. (C) לוחית האב שוכפלה במדיה סלקטיבית שונה כדי לזהות ולטהר את אותם הפלואידים ששילבו את הגן המיטוכונדריאלי המיועד בדנ”א של האברון (XPM209)²⁵. קיצורים: -ADE = חסר אדנין; -LEU = חסר לאוצין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.