Baker 中的线粒体转化

酵母酿酒酵母是一种被广泛认可的用于研究线粒体生物发生的模型。由于酵母是一种厌氧的兼性生物，因此可以广泛研究引入损害呼吸的突变的原因和后果。此外，这种生物体拥有友好的遗传和生化工具来研究线粒体途径。然而，探索呼吸复合物组装和线粒体蛋白质合成机制的最强大资源之一是转化线粒体和修饰细胞器基因组的能力。以前，在线粒体 DNA （mtDNA） 中引入点突变或小缺失/插入 1,2,3,4,5，^删除基因 ^6,7，进行基因重排 ^7,8，为线粒体蛋白添加表位 ^9,10，将基因从细胞核重新定位到线粒体¹¹，¹²，并引入 BarStar¹³、GFP^14,15、荧光素酶¹⁶ 和最广泛使用的 ARG8^m17,18 等报告基因。线粒体基因组修饰使我们能够解剖和识别原本难以理解的机制。例如，插入线粒体 DNA 中 COX1 基因座的 ARG8^m 报告基因对于理解 Mss51 在 Cox1 生物发生中具有双重作用至关重要。首先，它是 COX1 mRNA 的翻译激活剂，其次，它是新制备的 Cox1 蛋白的组装伴侣 ^7,19。这项工作提出了一种转化酿酒酵母线粒体的详细方法。尽管线粒体转化方案较早发布 16,20,21,22,23，但通过视频的视觉方法对于彻底了解该方法的不同阶段和细节至关重要。该方法由各个步骤组成，分为四个一般阶段：

图 1：通过高速微弹轰击进行线粒体转化过程的概述：1） 在 DNA 包被之前对钨颗粒进行消毒和制备。2） 两种不同的质粒沉淀在 WP 表面。一种是含有将被定向到线粒体基质的构建体的细菌质粒。另一种是携带营养缺陷型标记物的核酵母表达载体。3） 缺乏线粒体 DNA （rho⁰） 的受体酵母菌株生长在半乳糖或棉子糖等发酵碳源上，它不会对线粒体基因表达产生任何葡萄糖抑制^{作用 34,35}。培养物铺布在含有轰击培养基的培养皿上。4） 用质粒包被的 WP 通过高速微弹轰击射向受体菌株。5） 通过与测试菌株交配来选择含有线粒体质粒的阳性合成 rho^– 菌落。6） 线粒体构建体通过称为细胞诱导的过程将合成的 rho^– 菌株（供体）与受体菌株交配，从而在所需的基因座处整合到线粒体基因组中。7） 选择携带线粒体构建体的阳性受体单倍体菌株并在不同的培养基中纯化。缩写： WPs = 钨颗粒;mtDNA = 线粒体 DNA。请单击此处查看此图的较大版本。

用旨在整合到线粒体基因组中的 DNA 构建体转化细胞 （图 1，步骤 1-4）
虽然可以直接转化含有完整线粒体基因组 （rho⁺） 的酵母，但如果细胞缺乏线粒体 DNA （rho⁰）²⁴，转化效率会提高 10-20 倍。钨颗粒 （WP） 包被有两种不同的质粒，它们将被共转化。第一个是携带营养缺陷型标志物的酵母 2 μ表达载体，例如 LEU2 或 URA3 （分别为 YEp351 或 YEp352）。如果 DNA 成功生物引入酵母细胞，转化体将在营养缺陷型培养基（即缺乏亮氨酸或尿嘧啶的培养基）上生长。该质粒有助于对获得核质粒的细胞进行首次选择;否则，所得菌落的数量将使板饱和。第二质粒是细菌质粒（如 pBluescript 或类似物），包含旨在整合到线粒体基因组中的线粒体结构。该构建体必须包含至少 100 nt 的 5′ 和 3′ 侧翼线粒体序列，以便与感兴趣的线粒体区域重组。根据我们的经验，较大的侧翼序列更有可能成功地与线粒体基因组中的靶基因座重组。

一个具体的例子如图 2²⁵ 所示。在这个例子中，目的是删除编码相应蛋白质 （Cox1ΔC15） 最后 15 个氨基酸的线粒体 COX1 基因区域（图 2A）。携带 COX1ΔC15 突变的细菌质粒分别含有 395 nt 和 990 nt 的基因 5′ 和 3′ 非翻译区。质粒来源于 pBluescript （pXPM61），并与 2 μ质粒 YEp352 一起在 WP 表面共沉淀（图 2B）。然后通过微弹轰击将 WP 引入选定的受体菌株（图 2C）。该菌株名为 NAB69²⁶，是一种带有 kar1-1 和 ade2 等位基因的 MATa、rho⁰ 菌株（这些特性的重要性将在下面讨论）。将细胞接种在缺乏尿嘧啶的轰炸培养基上，以选择获得 2 μ质粒的细胞（图 2C）。细胞在 30 °C 下生长 5-7 晚。

选择获得含有线粒体构建体的细菌质粒和携带营养缺陷型标记物的核 2 μ质粒的细胞 （图 1， 步骤 5）
阳性菌落将在其线粒体²² 中保持细菌质粒的许多拷贝。由于转化的细胞最初是 rho⁰，因此没有线粒体序列支持质粒中存在的线粒体构建体的翻译;因此，转化的线粒体基因不会表达。有必要将转化体与测试菌株交配，以检测获得线粒体质粒的酵母菌落。测试菌株的线粒体基因组包含目标基因的非功能性突变版本。交配后，线粒体会融合，转化质粒中包含的线粒体序列将与来自测试菌株的突变线粒体基因重组;因此，WT 基因的恢复将重建功能。得到的二倍体将具有可检测的阳性表型（通常在呼吸介质或缺乏精氨酸的介质中生长的能力）。线粒体中携带细菌质粒的阳性细胞称为“合成^{红细胞”。}在图 2D 的具体示例中，携带 COX1ΔC15 构建体（名为 XPM199）的合成 ^rho 细胞被复制接种在缺乏尿嘧啶的培养基上（这是从中纯化阳性菌落的母板）。他们还在测试菌株 L45²⁷ 草坪上进行了复制接种，该菌株包含无功能突变 cox1D369N。交配两晚后，L45 和 XPM199 的线粒体基因组重组，产生功能性 COX1 基因;因此，二倍体恢复了在呼吸介质上生长的能力。从主板中，我们挑选了阳性菌落。它们在缺乏尿嘧啶的平板上划线，并重复选择性测试以获得纯合成的 ^{rho 细胞}（图 2E）。需要注意的是，测试板仅用于鉴定合成 rho^– 菌落，不能从这些板中回收突变体。

将构建体整合到预期菌株的线粒体基因组中
此步骤是通过称为细胞诱导^28,29 的过程实现的（图 1，步骤 6）。在这种方法中，合成的 rho^– 菌株（供体菌株）与相反交配类型的预期受体菌株交配。一个基本要求是两种交配菌株中至少有一个携带 kar1-1 突变以阻止核聚变³⁰。因此，两个细胞的交配会产生双核受精卵（图 3）。来自亲本细胞（供体和受体）的线粒体网络融合，线粒体 DNA 分子重组。双核受精卵被孵育/回收以允许出芽，这将产生单倍体细胞。这些单倍体携带其中一个亲本细胞的核背景。同样，单倍体可以携带来自亲本细胞或目标重组线粒体 DNA 的线粒体 DNA。然而，kar1-1 突变并非 100% 有效，在交配过程中会形成一些真正的二倍体^28,29。合成 rho^– 菌株 （供体，XPM199） 携带示例中的 kar1-1 等位基因。作为选择性标记物，它具有 ade2 等位基因，使其成为腺嘌呤的营养缺陷型细胞（图 4）。受体菌株是 XPM10，一种带有 cox1Δ：：ARG8^m 构建体的 rho ⁺ 菌株，其中报告基因 ARG8^m 取代了线粒体基因组⁷ 中的 COX1 密码子。将两种细胞培养物的混合物作为液滴添加到 YPD 板中，以便进行交配。3-5 小时后，在光学显微镜下观察细胞以检测 shmoos 的形成（图 3B），这是一种与交配相关的细胞形状。孵育/恢复时间后，将双核受精卵接种在缺乏腺嘌呤的培养基上，以防止供体细胞的生长。

选择携带目标线粒体基因组的单倍体菌株 （图 1，步骤 7）
细胞诱导后存在供体、受体和二倍体细胞的混合物。因此，在孵育/回收双核受精卵后，细胞必须在不同的选择性培养基中生长，以鉴定和纯化感兴趣的单倍体。选择性培养基取决于供体的基因型、受体菌株和预期的线粒体结构。然而，一般来说，选择选择性培养基的原因是：i） 孵育/恢复后，细胞诱导混合物在供体亲本菌株无法生长的选择性培养基上生长。在图 4A、B 的具体示例中，供体（合成 rho^–菌株）携带无功能的 ade2 等位基因。因此，细胞诱导混合物必须在缺乏腺嘌呤的培养基板上孵育。这是主板。ii） 一旦菌落生长，在缺乏腺嘌呤的培养基上再次复制母板（以生成新的母板，从中纯化感兴趣的阳性菌落），然后，在只有二倍体可以生长的培养基上复制。这是避免进一步无意中纯化二倍体集落所必需的。在图 4C 中的示例中，只有二倍体可以在缺乏亮氨酸的培养基上生长。iii） 母板也在培养基上复制，其中只有那些包含目标线粒体 DNA 的受体单倍体才会生长。在图 4C 的示例中，单倍体在含有乙醇/甘油作为碳源的呼吸培养基上生长，因为 Cox1ΔC15 蛋白具有功能。所得的带有目标 mtDNA 的 rho ⁺ 菌株被命名为 XPM209²⁵。 表 2 和图 4 中使用的菌株列在表 1 中。

图 2：描述线粒体转化和阳性 rho 细胞选择的具体示例的图表。 （A） 线粒体基因组的预期修饰是编码 Cox1 亚基最后 15 个氨基酸的区域 （Cox1ΔC15） 的缺失。（B） WPs 包被两个质粒以转化酵母细胞。一个是在细胞核中定向和表达的 2 μ质粒 Yep352。另一个是质粒 pXPM61，它包含 COX1ΔC15 等位基因以及 COX1 5′ 和 3′-UTR 的 395 nt 和 990 nt。（C） WPs 从缺乏线粒体 DNA 的菌株 NAB69 （rho⁰ 菌株） 引入细胞中。从轰击板获得的转化菌落在缺乏尿嘧啶的培养基上复制，尿嘧啶是核质粒 YEp352 的营养缺陷型标志物。（D） 为了选择阳性 rho^– 菌落，在缺乏尿嘧啶的培养基上复制 -URA 板。这是从中挑选和分离阳性菌落的母板。它还在具有富介质 （YPD） 的板和测试菌株的草坪上进行了复制。在交配过程中，合成的线粒体 DNA 与来自测试菌株 L45²⁷ 的线粒体 DNA 重组，该菌株携带 COX1 基因 （D369N） 突变。在呼吸培养基上生长的二倍体包含转化的 DNA。从主板中挑选相应的菌落进行复位和纯化。为了帮助识别所有复制铺板中母板中的阳性菌落，在板的边缘（绿线）上用永久性标记进行标记。（E） 将选定的阳性菌落重新放置在缺乏尿嘧啶的培养基上。这是新的主板。与 D 中一样，又进行了两轮测试以纯化合成的^红菌落。缩写： WPs = 钨颗粒;mtDNA = 线粒体 DNA;-URA/Sorb = 缺乏尿嘧啶/含有山梨醇;WT = 野生型。请单击此处查看此图的较大版本。

图 3：描述细胞诱导程序的图表。 （A） 细胞诱导过程中细胞如何交配的一般概述。在细胞诱导过程中，来自供体菌株和受体菌株的线粒体融合，因此来自两种菌株的线粒体 DNA 重新组合。由于 kar1-1 突变³⁰ 导致核融合减少，因此形成了双核受精卵。经过一段时间的孵育/恢复时间后，选择包含预期线粒体突变的双核受精卵芽和单倍体受体。（B） 合成的 rho^– 菌株（供体）和受体菌株通过细胞诱导交配，可以形成 shmoos（红色箭头），这是交配酵母的一种特征形状。图像是在光学显微镜下用 100 倍物镜拍摄的。比例尺 = 10 μm。 请点击此处查看此图的较大版本。

图 4：描述细胞诱导以将突变 COX1ΔC15 整合到线粒体基因组中的具体示例的图表。 （A） 将合成 rho^– 菌株（供体，XPM199）和目标菌株（受体，XPM10）的液体培养物混合进行交配。shmoo 形成后，将混合物在液体培养物中回收 2-4 小时。接下来，将细胞诱导混合物铺在装有缺乏腺嘌呤的培养基的平板上，以防止供体细胞的生长。（B） 细胞诱导过程中来自供体 （XPM199） 和受体 （XPM10） 的线粒体 DNA 重组事件的示意图。（C） 将母板复制到不同的选择性培养基上，以识别和纯化那些将预期线粒体基因整合到细胞器 DNA 中的单倍体 （XPM209）²⁵。缩写： -ADE = 缺乏腺嘌呤;-LEU = 缺乏亮氨酸。 请单击此处查看此图的较大版本。