Summary

טרנספורמציה מיטוכונדריאלית בבייקר

Published: June 07, 2024
doi:

Summary

עבודה זו מסבירה כיצד לשנות מיטוכונדריה של שמרים באמצעות שיטה ביוליסטית. אנו גם מראים כיצד לבחור ולטהר את הטרנספורמנטים וכיצד להציג את המוטציה הרצויה במיקום המטרה בתוך הגנום המיטוכונדריאלי.

Abstract

שמרי אפייה Saccharomyces cerevisiae נמצאים בשימוש נרחב להבנת הביולוגיה של המיטוכונדריה מזה עשרות שנים. מודל זה סיפק ידע על מסלולים מיטוכונדריאליים חיוניים ושמורים בקרב איקריוטים, ומסלולים ספציפיים לפטריות או שמרים. אחת היכולות הרבות של S. cerevisiae היא היכולת לתמרן את הגנום המיטוכונדריאלי, אשר עד כה אפשרי רק ב – S. cerevisiae ובאצות החד-תאיות Chlamydomonas reinhardtii. השינוי הביולוגי של מיטוכונדריית שמרים מאפשר לנו להציג מוטציות מכוונות אתר, לבצע סידורים מחדש של גנים ולהציג כתבים. גישות אלה משמשות בעיקר להבנת המנגנונים של שני תהליכים מתואמים מאוד במיטוכונדריה: תרגום על ידי מיטוריבוזומים והרכבה של קומפלקסים נשימתיים וסינתאז ATP. עם זאת, טרנספורמציה מיטוכונדריאלית יכולה לשמש באופן פוטנציאלי לחקר מסלולים אחרים. בעבודה הנוכחית אנו מראים כיצד לשנות מיטוכונדריה של שמרים באמצעות הפצצת מיקרו-קליע במהירות גבוהה, לבחור ולטהר את הטרנספורמציה המיועדת, ולהציג את המוטציה הרצויה בגנום המיטוכונדריאלי.

Introduction

שמרי Saccharomyces cerevisiae הם מודל מוכר המשמש לחקר ביוגנזה מיטוכונדריאלית. מכיוון ששמרים הם אורגניזם אנאירובי, פקולטטיבי, ניתן ללמוד בהרחבה את הסיבות וההשלכות של החדרת מוטציות הפוגעות בנשימה. בנוסף, אורגניזם זה בעל כלים גנטיים וביוכימיים ידידותיים לחקר מסלולים מיטוכונדריאליים. עם זאת, אחד המשאבים החזקים ביותר לחקור את מנגנוני הרכבת קומפלקס הנשימה וסינתזה של חלבון מיטוכונדריאלי הוא היכולת לשנות מיטוכונדריה ולשנות את הגנום של אברונים. בעבר, היה מועיל להכניס לדנ”א המיטוכונדריאלי (mtDNA) מוטציות נקודתיות או מחיקות/החדרות קטנות 1,2,3,4,5, למחוק גנים 6,7, לבצע סידורים מחדש של גנים 7,8, להוסיף אפיטופים לחלבונים מיטוכונדריאליים 9,10, להעביר גנים מהגרעין למיטוכונדריה11,12, ולהציג גנים כתבים כמו BarStar13, GFP14,15, luciferase16, ואת ARG8m17,18 הנפוץ ביותר. שינויים בגנום המיטוכונדריאלי אפשרו לנו לנתח ולזהות מנגנונים שאחרת היו קשים להבנה. לדוגמה, הגן ARG8m reporter שהוחדר למוקד COX1 בדנ”א המיטוכונדריאלי היה חיוני להבנה של-Mss51 יש תפקיד כפול בביוגנזה של Cox1. ראשית, הוא מפעיל תרגום של ה-mRNA COX1, ושנית, הוא מלווה הרכבהשל חלבון Cox1 החדש 7,19. עבודה זו מציגה שיטה מפורטת לשינוי מיטוכונדריה של S. cerevisiae. למרות שפרוטוקול השינוי המיטוכונדריאלי פורסם מוקדם יותר 16,20,21,22,23, גישה חזותית באמצעות וידאו חיונית כדי להבין ביסודיות את השלבים והפרטים השונים של השיטה. השיטה מורכבת משלבים שונים ומחולקת לארבעה שלבים כלליים:

Figure 1
איור 1: סקירה כללית של תהליך הטרנספורמציה של המיטוכונדריה על-ידי הפצצת מיקרו-קליע במהירות גבוהה: 1) חלקיקי הטונגסטן מעוקרים ומוכנים לפני ציפוי הדנ”א. 2) שני פלסמידים שונים מואצים על פני השטח של WPs. האחד הוא פלסמיד חיידקי המכיל את המבנה שיופנה למטריצה המיטוכונדריאלית. השני הוא וקטור ביטוי שמרים גרעיניים הנושא סמן אוקסוטרופיה. 3) זן שמרים קולטני חסר DNA מיטוכונדריאלי (rho0) גדל על מקור פחמן מותסס כמו גלקטוז או רפינוז, אשר אינו מפעיל כל דיכוי גלוקוז של ביטוי גנים מיטוכונדריאליים34,35. התרבות מתפשטת על צלחות פטרי המכילות את אמצעי ההפצצה. 4) WPs המצופים בפלסמידים נורים לזן הקולטן על ידי הפצצת מיקרו-קליע במהירות גבוהה. 5) מושבות רו סינתטיות חיוביות המכילות את הפלסמיד המיטוכונדריאלי נבחרות על ידי הזדווגות לזן בודק. 6) המבנה המיטוכונדריאלי משולב בגנום המיטוכונדריאלי במקום הרצוי על ידי זיווג זן הרו הסינתטי (תורם) עם הזן המקבל בתהליך המכונה ציטודוקציה. 7) הקולטן החיובי, הזן הפלואידי הנושא את המבנה המיטוכונדריאלי נבחר ומטוהר במדיות שונות. קיצורים: WPs = חלקיקי טונגסטן; mtDNA = DNA מיטוכונדריאלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טרנספורמציה של תאים עם מבנה דנ”א שנועד להשתלב בגנום המיטוכונדריאלי (איור 1, שלבים 1-4)
למרות שניתן לשנות ישירות שמרים המכילים גנום מיטוכונדריאלי שלם (rho+), השינוי יעיל פי 10-20 אם התאים חסרים DNA מיטוכונדריאלי (rho0)24. חלקיקי טונגסטן (WPs) מצופים בשני פלסמידים שונים שיומרו במשותף. הראשון הוא וקטור ביטוי שמרים 2 μ הנושא סמן אוקסוטרופי, כגון LEU2 או URA3 (למשל, YEp351 או YEp352, בהתאמה). אם ההחדרה הביוליסטית של דנ”א לתאי השמרים מוצלחת, הטרנספורמנטים יגדלו על מדיום האוקסוטרופיה (כלומר, מדיום חסר לאוצין או אורציל). פלסמיד זה מועיל בביצוע הבחירה הראשונה של התאים שרכשו את הפלסמיד הגרעיני; אחרת, מספר המושבות שייווצרו ירווה את הצלחת. הפלסמיד השני הוא פלסמיד חיידקי (כגון pBluescript או דומה) המכיל את המבנה המיטוכונדריאלי המיועד להשתלב בגנום המיטוכונדריאלי. המבנה חייב להכיל לפחות 100 nt של רצפים מיטוכונדריאליים של 5′ ו-3′ עבור רקומבינציה עם האזור המיטוכונדריאלי המעניין. מניסיוננו, רצפי איגוף גדולים יותר נוטים יותר להשתלב מחדש בהצלחה עם מוקד המטרה בגנום המיטוכונדריאלי.

דוגמה ספציפית מוצגת באיור 225. בדוגמה זו, המטרה הייתה למחוק את האזור של הגן COX1 במיטוכונדריה המקודד עבור 15 חומצות האמינו האחרונות של החלבון המתאים (Cox1ΔC15) (איור 2A). הפלסמיד החיידקי הנושא את המוטציה COX1ΔC15 הכיל 395 nt ו-990 nt מהאזורים הלא מתורגמים 5′ ו-3′ של הגן, בהתאמה. הפלסמיד נגזר מ-pBluescript (pXPM61), ויחד עם 2 μ פלסמיד YEp352, הם קואצו על פני השטח של WPs (איור 2B). לאחר מכן הוכנסו ה-WPs באמצעות הפצצת מיקרו-קליעים לתוך הזן המקבל שנבחר (איור 2C). זן זה, הנקרא NAB6926, הוא זן MATa, rho0 הנושא את האללים kar1-1 ו – ade2 (חשיבותם של מאפיינים אלה תידון להלן). התאים היו מצופים על אמצעי הפצצה חסרי אורציל כדי לבחור את אלה שרכשו את 2 μ פלסמיד (איור 2C). תאים גודלו במשך 5-7 לילות ב 30 מעלות צלזיוס.

בחירת התאים שרכשו את פלסמיד החיידקים המכיל את המבנה המיטוכונדריאלי ואת פלסמיד הגרעין 2 μ הנושא את סמן האוקסוטרופיה (איור 1, שלב 5)
המושבות החיוביות ישמרו עותקים רבים של פלסמיד החיידקים במיטוכונדריה22 שלהן. מאחר שהתאים שעברו טרנספורמציה הם במקור rho0, אין רצפים מיטוכונדריאליים התומכים בתרגום המבנה המיטוכונדריאלי הקיים בפלסמיד; לפיכך, הגן המיטוכונדריאלי שעבר טרנספורמציה לא יבוא לידי ביטוי. יש צורך להזדווג עם טרנספורמטים עם זן בודק כדי לזהות את מושבות השמרים שרכשו את פלסמיד המיטוכונדריה. הגנום המיטוכונדריאלי של זן הבודק מכיל גרסה מוטנטית לא מתפקדת של הגן המעניין. לאחר ההזדווגות, המיטוכונדריה יתמזגו, והרצף המיטוכונדריאלי הכלול בפלסמיד שעבר טרנספורמציה יתמזג מחדש עם הגן המיטוכונדריאלי שעבר מוטציה מזן הבודק; כתוצאה מכך, ההתאוששות של הגן WT תחזור לתפקד. הדיפלואיד המתקבל יהיה בעל פנוטיפ חיובי הניתן לזיהוי (בדרך כלל היכולת לגדול בתווך נשימתי או בתווך חסר ארגינין). התאים החיוביים הנושאים את פלסמיד החיידקים במיטוכונדריה נקראים “תאי רו סינתטיים”. בדוגמה הספציפית של איור 2D, תאי רו סינתטיים שנשאו את מבנה COX1ΔC15 (שנקרא XPM199) צופו מחדש על תווך חסר אורציל (זהו לוח האב שממנו טוהרו מושבות חיוביות). הם גם צופו בהעתק על מדשאה מזן בודק L4527, המכיל את המוטציה הלא פונקציונלית cox1D369N. לאחר הזדווגות של שני לילות, הגנום המיטוכונדריאלי של L45 ו-XPM199 התאחד מחדש, והתוצאה הייתה גן COX1 פונקציונלי; לכן, הדיפלואידים השיבו לעצמם את היכולת לגדול על אמצעי הנשימה. מצלחת המאסטר בחרנו את המושבות החיוביות. הם היו מפוספסים על לוחות חסרי אורציל, והבדיקות הסלקטיביות חזרו על עצמן כדי לקבל תאי רו סינתטיים טהורים (איור 2E). חשוב לציין כי לוחית הבדיקה מיועדת רק לזיהוי מושבות רו סינתטיות, ולא ניתן לשחזר מוטנטים מלוחות אלה.

שילוב המבנה בגנום המיטוכונדריאלי של הזן המיועד
שלב זה מושג על-ידי תהליך שנקרא ציטודוקציה28,29 (איור 1, שלב 6). בגישה זו, זן הרו הסינתטי (זן תורם) מזווג לזן המקבל המיועד מסוג ההזדווגות הנגדי. דרישה חיונית היא שלפחות אחד משני זני ההזדווגות יישא את מוטציית kar1-1 כדי לעכב היתוך גרעיני30. לפיכך, הזדווגות של שני התאים מייצרת זיגוטה דו-עינית (איור 3). הרשת המיטוכונדריאלית מתאי ההורים (תורם ומקבל) מתמזגת ומולקולות הדנ”א המיטוכונדריאלי משתלבות מחדש. הזיגוטה הדו-עינית מודגרת/משוחזרת כדי לאפשר ניצנים, אשר ייצרו תאים הפלואידים. הפלואידים האלה נושאים את הרקע הגרעיני של אחד מתאי ההורים. באופן דומה, הפלואידים יכולים לשאת את הדנ”א המיטוכונדריאלי מתא ההורים או מהדנ”א המיטוכונדריאלי המשולב מחדש. עם זאת, מוטציית kar1-1 אינה יעילה ב-100%, וכמה דיפלואידים אמיתיים ייווצרו במהלך ההזדווגות28,29. זן הרו הסינתטי (תורם, XPM199) נשא את האלל kar1-1 בדוגמה. כסמן סלקטיבי, היה לו אלל ade2, מה שהופך אותו לאוקסוטרופ עבור אדנין (איור 4). הזן המקבל היה XPM10, זן rho+ הנושא את המבנה cox1Δ::ARG8m, שבו הכתב ARG8m החליף את קודוני COX1 בגנום המיטוכונדריאלי7. התערובת של שתי תרביות התאים נוספה לצלחת YPD כטיפה כדי לאפשר הזדווגות. לאחר 3-5 שעות, התאים נצפו תחת מיקרוסקופ אור כדי לזהות היווצרות של שמוס (איור 3B), צורת תא שקשורה להזדווגות. לאחר זמן הדגירה/התאוששות, הזיגוטה הדו-גרעינית צופתה על תווך חסר אדנין כדי למנוע את צמיחת תאי התורם.

בחירת הזן הפלואידי הנושא את הגנום המיטוכונדריאלי המעניין (איור 1, שלב 7)
תערובת של תאים תורמים, מקבלים ודיפלואידים קיימת לאחר ציטודוקציה. לכן, לאחר הדגירה/התאוששות של הזיגוטה הדו-מינית, יש לגדל תאים במדיות סלקטיביות שונות כדי לזהות ולטהר את הפלואידים המעניינים. המדיה הסלקטיבית תלויה בגנוטיפים של התורם, בזנים המקבלים ובמבנה המיטוכונדריאלי המיועד. עם זאת, באופן כללי, הנימוקים לבחירת המדיה הסלקטיבית הם: i) לאחר הדגירה/התאוששות, תערובת הציטודוקציה גדלה על מדיום סלקטיבי שבו הזן ההורי התורם אינו יכול לגדול. בדוגמה הספציפית באיור 4A,B, התורם (זן רו סינתטי) נושא את אלל ade2 הלא פונקציונלי. לכן, תערובת cytoduction חייב להיות מודגר על צלחת בינונית חסר אדנין. זוהי צלחת המאסטר. ב) ברגע שהמושבות גדלות, צלחת המאסטר משוכפלת שוב על מדיום חסר אדנין (כדי ליצור צלחת מאסטר חדשה שממנה יטוהרו המושבות החיוביות המעניינות), ולאחר מכן, על מדיום שבו רק דיפלואידים יכולים לצמוח. זה הכרחי כדי למנוע טיהור נוסף בשוגג של מושבות דיפלואידיות. במקרה של הדוגמה מאיור 4C, רק דיפלואידים יכולים לגדול על מדיה חסרת לאוצין. iii) צלחת האב משוכפלת גם על מדיה שבה רק אותם הפלואידים המקבלים ששילבו את הדנ”א המיטוכונדריאלי של עניין יגדלו. בדוגמה של איור 4C, הפלואידים גדלים על מצע נשימתי המכיל אתנול/גליצרול כמקור פחמן, מאחר שהחלבון Cox1ΔC15 הוא פונקציונלי. זן rho+ שנוצר הנושא את mtDNA של עניין נקרא XPM20925. הזנים שבהם נעשה שימוש באיור 2 ובאיור 4 מפורטים בטבלה 1.

Figure 2
איור 2: דיאגרמה המתארת דוגמה ספציפית של טרנספורמציה מיטוכונדריאלית ובחירה של תאי רו חיוביים. (A) השינוי המיועד של הגנום המיטוכונדריאלי היה מחיקה של האזור המקודד עבור 15 חומצות האמינו האחרונות של תת-היחידה Cox1 (Cox1ΔC15). (B) WPs צופו בשני פלסמידים כדי להפוך תאי שמרים. אחד מהם היה 2 μ פלסמיד Yep352 שכוון ובא לידי ביטוי בגרעין. השני היה פלסמיד pXPM61, המכיל את אלל COX1ΔC15 בתוספת 395 nt ו-990 nt של COX1 5′ ו-3′-UTRs, בהתאמה. (C) WPs הוכנסו לתאים מהזן NAB69, אשר חסר DNA מיטוכונדריאלי (זן rho0). מושבות טרנספורמנטיות שהתקבלו מלוחות ההפצצה שוכפלו על תווך חסר אורציל, הסמן האוקסוטרופי של הפלסמיד הגרעיני YEp352. (D) כדי לבחור את מושבות הרו החיוביות, לוחית ה-URA שוכפלה על מדיה חסרת אורציל. זו הייתה צלחת המאסטר שממנה נקטפו ובודדו המושבות החיוביות. הוא שוכפל גם על לוחות עם מדיה עשירה (YPD) ומדשאה של זן טסטר. במהלך ההזדווגות, הדנ”א הרו-מיטוכונדריאלי הסינתטי שולב מחדש עם הדנ”א המיטוכונדריאלי מזן הבודק, L4527, הנושא מוטציה בגן COX1 (D369N). הדיפלואידים שגדלו על מצע הנשימה הכילו את הדנ”א שעבר טרנספורמציה. המושבות המקבילות נקטפו מצלחת המאסטר כדי לנוח ולטהר. כדי לסייע בזיהוי המושבות החיוביות בלוח האב לאורך כל ציפוי העתק, נעשו סימנים בטוש קבוע בשולי הלוחות (קווים ירוקים). (E) המושבות החיוביות שנבחרו הוחזרו על מדיום חסר אורציל. זו הייתה צלחת המאסטר החדשה. כמו ב-D, נערכו שני סבבי בדיקות נוספים לטיהור מושבות הרו הסינתטיות. קיצורים: WPs = חלקיקי טונגסטן; mtDNA = DNA מיטוכונדריאלי; -URA/Sorb = חסר אורציל/ המכיל סורביטול; WT = סוג פראי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: דיאגרמה המתארת את הליך הציטודוקציה. (A) סקירה כללית של האופן שבו תאים מזדווגים במהלך ציטודוקציה. במהלך הציטודוקציה, המיטוכונדריה מהזנים התורם והמקבל מתמזגים כך שהדנ”א המיטוכונדריאלי משני הזנים משתלב מחדש. מאז היתוך גרעיני מופחת עקב מוטציה kar1-1 30, זיגוטות דו גרעיניות נוצרים. לאחר זמן דגירה/התאוששות מסוים, נבחרים ניצני הזיגוטה הדו-גרעיניים וקולטי הפלואידים המכילים את המוטציה המיטוכונדריאלית המיועדת. (B) הזדווגות של זן הרו הסינתטי (תורם) והזן המקבל באמצעות ציטודוקציה מאפשרת היווצרות של שמואים (חיצים אדומים), צורה אופיינית של שמרי הזדווגות. התמונה צולמה תחת מיקרוסקופ אור עם מטרה של 100x. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: דיאגרמה המתארת דוגמה ספציפית של ציטודוקציה כדי לשלב את המוטציה COX1ΔC15 בגנום המיטוכונדריאלי. (A) תרביות נוזליות של זן הרו הסינתטי (תורם, XPM199) והזן המעניין (מקבל, XPM10) עורבבו כדי להזדווג. לאחר היווצרות שמו, התערובת נמצאה בתרבית נוזלית במשך 2-4 שעות. לאחר מכן, תערובת הציטודוקציה נמרחה על צלחת עם מדיום חסר אדנין כדי למנוע את צמיחת התאים התורמים. (B) ייצוג סכמטי של אירועי הרקומבינציה של הדנ”א המיטוכונדריאלי מהתורם (XPM199) ומהמקבל (XPM10) במהלך הציטודוקציה. (C) לוחית האב שוכפלה במדיה סלקטיבית שונה כדי לזהות ולטהר את אותם הפלואידים ששילבו את הגן המיטוכונדריאלי המיועד בדנ”א של האברון (XPM209)25. קיצורים: -ADE = חסר אדנין; -LEU = חסר לאוצין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Protocol

הערה: אנו ממליצים לבצע שש טרנספורמציות עבור כל מבנה מכיוון שיעילות הטרנספורמציה המיטוכונדריאלית היא בדרך כלל נמוכה. הרכב מצעי הגידול השונים מוצג בטבלה 2. 1. הכנת חלקיקי טונגסטן שקלו 30 מ”ג של חלקיקי טונגסטן 0.7 מיקרומטר (WPs, מיקרו-נשאים) במיקרו-צינור. הוסף…

Representative Results

חלק זה מציג כמה תוצאות מייצגות מהשלבים השונים של טרנספורמציה מיטוכונדריאלית. איור 6 מראה הליך הפצצה. תאי הרו הסינתטיים נשאו פלסמיד חיידקי עם הגן המדווח ARG8m, שיחליף את רצף הקידוד של גן מיטוכונדריאלי (איור 6A). לאחר ההפגזה, הלוח שוכפל על תווך חס?…

Discussion

העבודה הנוכחית תיארה כיצד להפוך מיטוכונדריה מהשמרים S. cerevisiae בהצלחה. התהליך, מהפצצת מיקרו-קליע במהירות גבוהה ועד לטיהור זן השמרים המיועד, אורך ~8-12 שבועות, תלוי בכמה סבבי טיהור של זן הרו הסינתטי הדרושים. חלק מהשלבים הקריטיים של השיטה הם כדלקמן. ראשית, ככל שאזורי האיגוף שנוספו סביב …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

פרסום זה נתמך על ידי Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), UNAM [IN223623 ל-XP-M]. UPD הוא עמית CONAHCYT (CVU:883299). אנו רוצים להודות לד”ר אריאן מנדוזה-מרטינז על העזרה הטכנית עם תמונות מיקרוסקופ האור. רישיונות Biorender: DU26OMVLUU (איור 2); BK26TH9GXH (איור 3); GD26TH80R5 (איור 4); PU26THARYD (איור 7); ML26THAIFG (איור 9).

Materials

1 mL pipette tips Axygen T-1000-B
1.5 mL Microtube Axygen MCT-150-C
10 μL pipette tips Axygen T-10-C
15 mL conical bottom tube  Axygen SCT-25ML-25-S
200 μL pipette tips Axygen T-200-Y
50 mL conical bottom  tube Axygen SCT-50ML-25-S
AfiII New England BioLabs R0520S
Agarose SeaKem 50004
Analytic balance OHAUS ARA520
Autoclave TOMY ES-315
Bacto agar BD 214010
Bacto peptone BD 211677
Biolisitic Macrocarrier holder  BIO-RAD 1652322
Bunsen burner VWR 89038-528
Calcium chloride Fisher Scientific C79-500
CSM -ADE Formedium DCS0049
CSM -ARG Formedium DCS0059
CSM -LEU Formedium DCS0099
CSM -URA Formedium DCS0169
Culture glass flask KIMAX KIMBLE 25615
Culture glass tube Pyrex 9820
Dextrose BD 215520
Ethanol JT Baker  9000
Forceps Millipore 620006
Glass beads Sigma Z265926
Glass handle Sigma S4647
Glycerol JT BAKER 2136-01
Helium tank grade 5 (99.99 %)
HSTaq  Kit PCR BIO
Microcentrifugue Eppendorf 022620100
NdeI New England BioLabs R0111L
Orbital shaker New Brunswick scientific NB-G25
PCR tubes Axygen PCR-02-C
PDS-1000/He TM Biolistic Particle Delivery System BIO-RAD 165-2257
Petri dishes (100X10) BD 252777
QIAprep Spin Miniprep Qiagen 27106
Raffinose Formedium RAF03
Replica plater Scienceware Z363391
Rupture discs 1350 Psi BIO-RAD 1652330
Sorbitol Sigma S7547
Spermidine Sigma S0266
T4 DNA Ligase Thermo Scientific EL0011
Tissue Culture Rotator Thermo Scientific 88882015
Tungsten microcarriers M10 BIO-RAD 1652266
Vaccum pump of 100L/min capacity
Velvet pads Bel-Art H37848-0002
Vortex  Scientifc Industries SI-0236
Wood aplicator stick PROMA 1820060
Yeast extract BD 212750
Yeast Nitrogen base without aminoacids BD 291920

References

  1. Bonnefoy, N., Fox, T. D. In vivo analysis of mutated initiation codons in the mitochondrial COX2 gene of Saccharomyces cerevisiae fused to the reporter gene ARG8m reveals lack of downstream reinitiation. Mol Gen Genet. 262 (6), 1036-1046 (2000).
  2. Franco, L. V. R., Su, C. H., McStay, G. P., Yu, G. J., Tzagoloff, A. Cox2p of yeast cytochrome oxidase assembles as a stand-alone subunit with the Cox1p and Cox3p modules. J Biol Chem. 293 (43), 16899-16911 (2018).
  3. Flores-Mireles, D., et al. The cytochrome b carboxyl terminal region is necessary for mitochondrial complex III assembly. Life Sci Alliance. 6 (7), (2023).
  4. Rubalcava-Gracia, D., Vázquez-Acevedo, M., Funes, S., Pérez-Martínez, X., González-Halphen, D. Mitochondrial versus nuclear gene expression and membrane protein assembly: the case of subunit 2 of yeast cytochrome. Mol Biol Cell. 29 (7), 820-833 (2018).
  5. García-Villegas, R., et al. The Cox1 C-terminal domain is a central regulator of cytochrome c oxidase biogenesis in yeast mitochondria. J Biol Chem. 292 (26), 10912-10925 (2017).
  6. Rak, M., et al. Yeast cells lacking the mitochondrial gene encoding the ATP synthase subunit 6 exhibit a selective loss of complex IV and unusual mitochondrial morphology. J Biol Chem. 282 (15), 10853-10864 (2007).
  7. Perez-Martinez, X., Broadley, S. A., Fox, T. D. Mss51p promotes mitochondrial Cox1p synthesis and interacts with newly synthesized Cox1p. EMBO J. 22 (21), 5951-5961 (2003).
  8. Sanchirico, M. E., Fox, T. D., Mason, T. L. Accumulation of mitochondrially synthesized Saccharomyces cerevisiae Cox2p and Cox3p depends on targeting information in untranslated portions of their mRNAs. EMBO J. 17 (19), 5796-5804 (1998).
  9. Saracco, S. A., Fox, T. D. Cox18p is required for export of the mitochondrially encoded Saccharomyces cerevisiae Cox2p C-tail and interacts with Pnt1p and Mss2p in the inner membrane. Mol Biol Cell. 13 (4), 1122-1131 (2002).
  10. McStay, G. P., Su, C. H., Thomas, S. M., Xu, J. T., Tzagoloff, A. Characterization of assembly intermediates containing subunit 1 of yeast cytochrome oxidase. J Biol Chem. 288 (37), 26546-26556 (2013).
  11. Golik, P., Bonnefoy, N., Szczepanek, T., Saint-Georges, Y., Lazowska, J. The Rieske FeS protein encoded and synthesized within mitochondria complements a deficiency in the nuclear gene. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (15), 8844-8849 (2003).
  12. Franco, L. V. R., et al. Allotopic expression of COX6 elucidates Atco-driven co-assembly of cytochrome oxidase and ATP synthase. Life Sci Alliance. 6 (11), e202301965 (2023).
  13. Mireau, H., Arnal, N., Fox, T. D. Expression of Barstar as a selectable marker in yeast mitochondria. Mol Genet Genomics. 270 (1), 1-8 (2003).
  14. Cohen, J. S., Fox, T. D. Expression of green fluorescent protein from a recoded gene inserted into Saccharomyces cerevisiae mitochondrial DNA. Mitochondrion. 1 (2), 181-189 (2001).
  15. Suhm, T., et al. A novel system to monitor mitochondrial translation in yeast. Microb Cell. 5 (3), 158-164 (2018).
  16. Rzepka, M., Suhm, T., Ott, M. Incorporation of reporter genes into mitochondrial DNA in budding yeast. STAR Protoc. 3 (2), 101359 (2022).
  17. Steele, D. F., Butler, C. A., Fox, T. D. Expression of a recoded nuclear gene inserted into yeast mitochondrial DNA is limited by mRNA-specific translational activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (11), 5253-5257 (1996).
  18. Flores-Mireles, D., Camacho-Villasana, Y., Pérez-Martínez, X. The ARG8m reporter for the study of yeast mitochondrial translation. Methods Mol Biol. 2661, 281-301 (2023).
  19. Perez-Martinez, X., Butler, C. A., Shingu-Vazquez, M., Fox, T. D. Dual functions of Mss51 couple synthesis of Cox1 to assembly of cytochrome c oxidase in Saccharomyces cerevisiae mitochondria. Mol Biol Cell. 20 (20), 4371-4380 (2009).
  20. Bonnefoy, N., Remacle, C., Fox, T. D. Genetic transformation of Saccharomyces cerevisiae and Chlamydomonas reinhardtii mitochondria. Methods Cell Biol. 80, 525-548 (2007).
  21. Veloso Ribeiro Franco, L., Barros, M. H. Biolistic transformation of the yeast Saccharomyces cerevisiae mitochondrial DNA. IUBMB Life. 75 (12), 972-982 (2023).
  22. Bonnefoy, N., Fox, T. D. Directed alteration of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial DNA by biolistic transformation and homologous recombination. Methods Mol Biol. 372, 153-166 (2007).
  23. Butow, R. A., Henke, R. M., Moran, J. V., Belcher, S. M., Perlman, P. S. Transformation of Saccharomyces cerevisiae mitochondria using the biolistic gun. Methods Enzymol. 264, 265-278 (1996).
  24. Bonnefoy, N., Fox, T. D. Genetic transformation of Saccharomyces cerevisiae mitochondria. Methods Cell Biol. 65, 381-396 (2001).
  25. Shingú-Vázquez, M., et al. The carboxyl-terminal end of Cox1 is required for feedback assembly regulation of Cox1 synthesis in Saccharomyces cerevisiae mitochondria. J Biol Chem. 285 (45), 34382-34389 (2010).
  26. Bonnefoy, N., Bsat, N., Fox, T. D. Mitochondrial translation of Saccharomyces cerevisiae COX2 mRNA is controlled by the nucleotide sequence specifying the pre-Cox2p leader peptide. Mol Cell Biol. 21 (7), 2359-2372 (2001).
  27. Meunier, B., Lemarre, P., Colson, A. M. Genetic screening in Saccharomyces cerevisiae for large numbers of mitochondrial point mutations which affect structure and function of catalytic subunits of cytochrome-c oxidase. Eur J Biochem. 213 (1), 129-135 (1993).
  28. Dorweiler, J. E., Manogaran, A. L. Cytoduction and plasmiduction in yeast. Bio Protoc. 11 (17), e4146 (2021).
  29. Zakharov, I. A., Yarovoy, B. P. Cytoduction as a new tool in studying the cytoplasmic heredity in yeast. Mol Cell Biochem. 14 (1-3), 15-18 (1977).
  30. Conde, J., Fink, G. R. A mutant of Saccharomyces cerevisiae defective for nuclear fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (10), 3651-3655 (1976).
  31. Burke, D., Dawson, D., Stearns, T. . Methods in yeast genetics : a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. , (2000).
  32. Dunham, M. J., Gartenberg, M. R., Brown, G. W. . Methods in yeast genetics and genomics : a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. , (2015).
  33. Ding, M. G., et al. Chapter 27 An improved method for introducing point mutations into the mitochondrial cytochrome B gene to facilitate studying the role of cytochrome B in the formation of reactive oxygen species. Methods Enzymol. 456, 491-506 (2009).
  34. Klein, C. J. L., Olsson, L., Nielsen, J. Glucose control in Saccharomyces cerevisiae: the role of Mig1 in metabolic functions. Microbiology (Reading). 144 (Pt 1), 13-24 (1998).
  35. Rolland, F., Winderickx, J., Thevelein, J. M. Glucose-sensing and -signalling mechanisms in yeast. FEMS Yeast Res. 2 (2), 183-201 (2002).
  36. Gruschke, S., et al. The Cbp3-Cbp6 complex coordinates cytochrome b synthesis with bc(1) complex assembly in yeast mitochondria. J Cell Biol. 199 (1), 137-150 (2012).
  37. Seshadri, S. R., Banarjee, C., Barros, M. H., Fontanesi, F. The translational activator Sov1 coordinates mitochondrial gene expression with mitoribosome biogenesis. Nucleic Acids Res. 48 (12), 6759-6774 (2020).
  38. Rak, M., Tzagoloff, A. F1-dependent translation of mitochondrially encoded Atp6p and Atp8p subunits of yeast ATP synthase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18509-18514 (2009).
  39. He, S., Fox, T. D. Mutations affecting a yeast mitochondrial inner membrane protein, pnt1p, block export of a mitochondrially synthesized fusion protein from the matrix. Mol Cell Biol. 19 (10), 6598-6607 (1999).
  40. Rak, M., et al. Regulation of mitochondrial translation of the ATP8/ATP6 mRNA by Smt1p. Mol Biol Cell. 27 (6), 919-929 (2016).
  41. Barrera-Paez, J. D., Moraes, C. T. Mitochondrial genome engineering coming-of-age. Trends Genet. 38 (8), 869-880 (2022).
This article has been published
Video Coming Soon
Keep me updated:

.

Citer Cet Article
Camacho-Villasana, Y., Pedroza-Dávila, U., Perez-Martinez, X. Mitochondrial Transformation in Baker's Yeast to Study Translation and Respiratory Complex Assembly. J. Vis. Exp. (208), e66856, doi:10.3791/66856 (2024).

View Video