Summary

Baker 中的线粒体转化

Published: June 07, 2024
doi:

Summary

这项工作解释了如何使用生物方法转化酵母线粒体。我们还展示了如何选择和纯化转化体,以及如何在线粒体基因组中的靶位置引入所需的突变。

Abstract

几十年来,面包酵母酿酒 酵母已被广泛 用于了解线粒体生物学。该模型提供了有关真核生物中基本、保守的线粒体途径以及真菌或酵母特异性途径的知识。 酿酒酵母 的众多能力之一是操纵线粒体基因组的能力,到目前为止,这仅在 酿酒酵母 和单细胞藻类 莱茵衣藻中是可能的。酵母线粒体的生物转化使我们能够引入定点突变、进行基因重排并引入报告基因。这些方法主要用于了解线粒体中两个高度协调的过程的机制:线粒体核糖体的翻译以及呼吸复合物和 ATP 合酶的组装。然而,线粒体转化可能用于研究其他途径。在本工作中,我们展示了如何通过高速微弹轰击转化酵母线粒体,选择和纯化预期的转化体,并在线粒体基因组中引入所需的突变。

Introduction

酵母酿酒酵母是一种被广泛认可的用于研究线粒体生物发生的模型。由于酵母是一种厌氧的兼性生物,因此可以广泛研究引入损害呼吸的突变的原因和后果。此外,这种生物体拥有友好的遗传和生化工具来研究线粒体途径。然而,探索呼吸复合物组装和线粒体蛋白质合成机制的最强大资源之一是转化线粒体和修饰细胞器基因组的能力。以前,在线粒体 DNA (mtDNA) 中引入点突变或小缺失/插入 1,2,3,4,5删除基因 6,7,进行基因重排 7,8,为线粒体蛋白添加表9,10,将基因从细胞核重新定位到线粒体1112,并引入 BarStar13、GFP14,15、荧光素酶16 和最广泛使用的 ARG8m17,18 等报告基因。线粒体基因组修饰使我们能够解剖和识别原本难以理解的机制。例如,插入线粒体 DNA 中 COX1 基因座的 ARG8m 报告基因对于理解 Mss51 在 Cox1 生物发生中具有双重作用至关重要。首先,它是 COX1 mRNA 的翻译激活剂,其次,它是新制备的 Cox1 蛋白的组装伴侣 7,19。这项工作提出了一种转化酿酒酵母线粒体的详细方法。尽管线粒体转化方案较早发布 16,20,21,22,23,但通过视频的视觉方法对于彻底了解该方法的不同阶段和细节至关重要。该方法由各个步骤组成,分为四个一般阶段:

Figure 1
图 1:通过高速微弹轰击进行线粒体转化过程的概述:1) 在 DNA 包被之前对钨颗粒进行消毒和制备。2) 两种不同的质粒沉淀在 WP 表面。一种是含有将被定向到线粒体基质的构建体的细菌质粒。另一种是携带营养缺陷型标记物的核酵母表达载体。3) 缺乏线粒体 DNA (rho0) 的受体酵母菌株生长在半乳糖或棉子糖等发酵碳源上,它不会对线粒体基因表达产生任何葡萄糖抑制作用 34,35。培养物铺布在含有轰击培养基的培养皿上。4) 用质粒包被的 WP 通过高速微弹轰击射向受体菌株。5) 通过与测试菌株交配来选择含有线粒体质粒的阳性合成 rho 菌落。6) 线粒体构建体通过称为细胞诱导的过程将合成的 rho 菌株(供体)与受体菌株交配,从而在所需的基因座处整合到线粒体基因组中。7) 选择携带线粒体构建体的阳性受体单倍体菌株并在不同的培养基中纯化。缩写: WPs = 钨颗粒;mtDNA = 线粒体 DNA。请单击此处查看此图的较大版本。

用旨在整合到线粒体基因组中的 DNA 构建体转化细胞图 1,步骤 1-4)
虽然可以直接转化含有完整线粒体基因组 (rho+) 的酵母,但如果细胞缺乏线粒体 DNA (rho024,转化效率会提高 10-20 倍。钨颗粒 (WP) 包被有两种不同的质粒,它们将被共转化。第一个是携带营养缺陷型标志物的酵母 2 μ表达载体,例如 LEU2URA3 (分别为 YEp351 或 YEp352)。如果 DNA 成功生物引入酵母细胞,转化体将在营养缺陷型培养基(即缺乏亮氨酸或尿嘧啶的培养基)上生长。该质粒有助于对获得核质粒的细胞进行首次选择;否则,所得菌落的数量将使板饱和。第二质粒是细菌质粒(如 pBluescript 或类似物),包含旨在整合到线粒体基因组中的线粒体结构。该构建体必须包含至少 100 nt 的 5′ 和 3′ 侧翼线粒体序列,以便与感兴趣的线粒体区域重组。根据我们的经验,较大的侧翼序列更有可能成功地与线粒体基因组中的靶基因座重组。

一个具体的例子如图 225 所示。在这个例子中,目的是删除编码相应蛋白质 (Cox1ΔC15) 最后 15 个氨基酸的线粒体 COX1 基因区域(图 2A)。携带 COX1ΔC15 突变的细菌质粒分别含有 395 nt 和 990 nt 的基因 5′ 和 3′ 非翻译区。质粒来源于 pBluescript (pXPM61),并与 2 μ质粒 YEp352 一起在 WP 表面共沉淀(图 2B)。然后通过微弹轰击将 WP 引入选定的受体菌株(图 2C)。该菌株名为 NAB6926,是一种带有 kar1-1 ade2 等位基因的 MATa、rho0 菌株(这些特性的重要性将在下面讨论)。将细胞接种在缺乏尿嘧啶的轰炸培养基上,以选择获得 2 μ质粒的细胞(图 2C)。细胞在 30 °C 下生长 5-7 晚。

选择获得含有线粒体构建体的细菌质粒和携带营养缺陷型标记物的核 2 μ质粒的细胞图 1步骤 5)
阳性菌落将在其线粒体22 中保持细菌质粒的许多拷贝。由于转化的细胞最初是 rho0,因此没有线粒体序列支持质粒中存在的线粒体构建体的翻译;因此,转化的线粒体基因不会表达。有必要将转化体与测试菌株交配,以检测获得线粒体质粒的酵母菌落。测试菌株的线粒体基因组包含目标基因的非功能性突变版本。交配后,线粒体会融合,转化质粒中包含的线粒体序列将与来自测试菌株的突变线粒体基因重组;因此,WT 基因的恢复将重建功能。得到的二倍体将具有可检测的阳性表型(通常在呼吸介质或缺乏精氨酸的介质中生长的能力)。线粒体中携带细菌质粒的阳性细胞称为“合成红细胞”。图 2D 的具体示例中,携带 COX1ΔC15 构建体(名为 XPM199)的合成 rho 细胞被复制接种在缺乏尿嘧啶的培养基上(这是从中纯化阳性菌落的母板)。他们还在测试菌株 L4527 草坪上进行了复制接种,该菌株包含无功能突变 cox1D369N。交配两晚后,L45 和 XPM199 的线粒体基因组重组,产生功能性 COX1 基因;因此,二倍体恢复了在呼吸介质上生长的能力。从主板中,我们挑选了阳性菌落。它们在缺乏尿嘧啶的平板上划线,并重复选择性测试以获得纯合成的 rho 细胞图 2E)。需要注意的是,测试板仅用于鉴定合成 rho 菌落,不能从这些板中回收突变体。

将构建体整合到预期菌株的线粒体基因组中
此步骤是通过称为细胞诱导28,29 的过程实现的(图 1步骤 6)。在这种方法中,合成的 rho 菌株(供体菌株)与相反交配类型的预期受体菌株交配。一个基本要求是两种交配菌株中至少有一个携带 kar1-1 突变以阻止核聚变30。因此,两个细胞的交配会产生双核受精卵(图 3)。来自亲本细胞(供体和受体)的线粒体网络融合,线粒体 DNA 分子重组。双核受精卵被孵育/回收以允许出芽,这将产生单倍体细胞。这些单倍体携带其中一个亲本细胞的核背景。同样,单倍体可以携带来自亲本细胞或目标重组线粒体 DNA 的线粒体 DNA。然而,kar1-1 突变并非 100% 有效,在交配过程中会形成一些真正的二倍体28,29。合成 rho 菌株 (供体,XPM199) 携带示例中的 kar1-1 等位基因。作为选择性标记物,它具有 ade2 等位基因,使其成为腺嘌呤的营养缺陷型细胞(图 4)。受体菌株是 XPM10,一种带有 cox1Δ::ARG8m 构建体的 rho + 菌株,其中报告基因 ARG8m 取代了线粒体基因组7 中的 COX1 密码子。将两种细胞培养物的混合物作为液滴添加到 YPD 板中,以便进行交配。3-5 小时后,在光学显微镜下观察细胞以检测 shmoos 的形成图 3B),这是一种与交配相关的细胞形状。孵育/恢复时间后,将双核受精卵接种在缺乏腺嘌呤的培养基上,以防止供体细胞的生长。

选择携带目标线粒体基因组的单倍体菌株图 1,步骤 7)
细胞诱导后存在供体、受体和二倍体细胞的混合物。因此,在孵育/回收双核受精卵后,细胞必须在不同的选择性培养基中生长,以鉴定和纯化感兴趣的单倍体。选择性培养基取决于供体的基因型、受体菌株和预期的线粒体结构。然而,一般来说,选择选择性培养基的原因是:i) 孵育/恢复后,细胞诱导混合物在供体亲本菌株无法生长的选择性培养基上生长。在图 4A、B 的具体示例中,供体(合成 rho菌株)携带无功能的 ade2 等位基因。因此,细胞诱导混合物必须在缺乏腺嘌呤的培养基板上孵育。这是主板。ii) 一旦菌落生长,在缺乏腺嘌呤的培养基上再次复制母板(以生成新的母板,从中纯化感兴趣的阳性菌落),然后,在只有二倍体可以生长的培养基上复制。这是避免进一步无意中纯化二倍体集落所必需的。在图 4C 中的示例中,只有二倍体可以在缺乏亮氨酸的培养基上生长。iii) 母板也在培养基上复制,其中只有那些包含目标线粒体 DNA 的受体单倍体才会生长。在图 4C 的示例中,单倍体在含有乙醇/甘油作为碳源的呼吸培养基上生长,因为 Cox1ΔC15 蛋白具有功能。所得的带有目标 mtDNA 的 rho + 菌株被命名为 XPM20925表 2图 4 中使用的菌株列在表 1 中。

Figure 2
图 2:描述线粒体转化和阳性 rho 细胞选择的具体示例的图表。 A) 线粒体基因组的预期修饰是编码 Cox1 亚基最后 15 个氨基酸的区域 (Cox1ΔC15) 的缺失。(B) WPs 包被两个质粒以转化酵母细胞。一个是在细胞核中定向和表达的 2 μ质粒 Yep352。另一个是质粒 pXPM61,它包含 COX1ΔC15 等位基因以及 COX1 5′ 和 3′-UTR 的 395 nt 和 990 nt。(C) WPs 从缺乏线粒体 DNA 的菌株 NAB69 (rho0 菌株) 引入细胞中。从轰击板获得的转化菌落在缺乏尿嘧啶的培养基上复制,尿嘧啶是核质粒 YEp352 的营养缺陷型标志物。(D) 为了选择阳性 rho 菌落,在缺乏尿嘧啶的培养基上复制 -URA 板。这是从中挑选和分离阳性菌落的母板。它还在具有富介质 (YPD) 的板和测试菌株的草坪上进行了复制。在交配过程中,合成的线粒体 DNA 与来自测试菌株 L4527 的线粒体 DNA 重组,该菌株携带 COX1 基因 (D369N) 突变。在呼吸培养基上生长的二倍体包含转化的 DNA。从主板中挑选相应的菌落进行复位和纯化。为了帮助识别所有复制铺板中母板中的阳性菌落,在板的边缘(绿线)上用永久性标记进行标记。(E) 将选定的阳性菌落重新放置在缺乏尿嘧啶的培养基上。这是新的主板。与 D 中一样,又进行了两轮测试以纯化合成的红菌落。缩写: WPs = 钨颗粒;mtDNA = 线粒体 DNA;-URA/Sorb = 缺乏尿嘧啶/含有山梨醇;WT = 野生型。请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图 3:描述细胞诱导程序的图表。 A) 细胞诱导过程中细胞如何交配的一般概述。在细胞诱导过程中,来自供体菌株和受体菌株的线粒体融合,因此来自两种菌株的线粒体 DNA 重新组合。由于 kar1-1 突变30 导致核融合减少,因此形成了双核受精卵。经过一段时间的孵育/恢复时间后,选择包含预期线粒体突变的双核受精卵芽和单倍体受体。(B) 合成的 rho 菌株(供体)和受体菌株通过细胞诱导交配,可以形成 shmoos(红色箭头),这是交配酵母的一种特征形状。图像是在光学显微镜下用 100 倍物镜拍摄的。比例尺 = 10 μm。 请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图 4:描述细胞诱导以将突变 COX1ΔC15 整合到线粒体基因组中的具体示例的图表。A) 将合成 rho 菌株(供体,XPM199)和目标菌株(受体,XPM10)的液体培养物混合进行交配。shmoo 形成后,将混合物在液体培养物中回收 2-4 小时。接下来,将细胞诱导混合物铺在装有缺乏腺嘌呤的培养基的平板上,以防止供体细胞的生长。(B) 细胞诱导过程中来自供体 (XPM199) 和受体 (XPM10) 的线粒体 DNA 重组事件的示意图。(C) 将母板复制到不同的选择性培养基上,以识别和纯化那些将预期线粒体基因整合到细胞器 DNA 中的单倍体 (XPM209)25。缩写: -ADE = 缺乏腺嘌呤;-LEU = 缺乏亮氨酸。 请单击此处查看此图的较大版本。

Protocol

注意:我们建议对每个构建体进行六次转化,因为线粒体转化效率通常较低。不同生长培养基的组成如 表 2 所示。 1. 钨颗粒制备 在微管中称取 30 mg 0.7 μm 钨颗粒(WPs、微载体)。加入 1.5 mL 70% 乙醇 (EtOH) 进行灭菌。涡旋 WP 并让它们在室温下静置 10 分钟。 在室温下以 13,200 x g 离心 15 分钟。向颗粒中加入 1.5 mL 无菌水,涡旋,…

Representative Results

本节介绍了线粒体转化不同阶段的一些代表性结果。图 6 显示了轰炸程序。合成的 rho-cell 携带带有报告基因 ARG8m 的细菌质粒,它将取代线粒体基因的编码序列(图 6A)。轰击后,在缺乏尿嘧啶 (-URA) 的培养基上复制板;这是主板(图 6B)。生长的菌落具有带有 URA3 营养缺陷型标记物的?…

Discussion

目前的工作描述了 如何成功地转化 酵母中的线粒体。该过程从高速微弹轰击到纯化预期的酵母菌株,需要 ~8-12 周,具体取决于合成 rho 菌株 需要多少轮纯化。该方法的一些关键步骤如下。首先,线粒体基因构建体中突变位点周围添加的侧翼区域越大,靶突变成功整合的可能性就越高。侧翼区域的最小尺寸为 ~100 nt;但是,强烈建议在突变的每一侧使用超过 500 nt。其次,在选择转化?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

本出版物得到了 Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT)、UNAM [IN223623 to XP-M] 的支持。UPD 是 CONAHCYT 研究员 (CVU:883299)。我们要感谢 Ariann Mendoza-Martínez 博士在光学显微镜图像方面提供的技术帮助。生物渲染许可证:DU26OMVLUU(图 2);BK26TH9GXH(图 3);GD26TH80R5(图 4);PU26THARYD(图 7);ML26THAIFG(图 9)。

Materials

1 mL pipette tips Axygen T-1000-B
1.5 mL Microtube Axygen MCT-150-C
10 μL pipette tips Axygen T-10-C
15 mL conical bottom tube  Axygen SCT-25ML-25-S
200 μL pipette tips Axygen T-200-Y
50 mL conical bottom  tube Axygen SCT-50ML-25-S
AfiII New England BioLabs R0520S
Agarose SeaKem 50004
Analytic balance OHAUS ARA520
Autoclave TOMY ES-315
Bacto agar BD 214010
Bacto peptone BD 211677
Biolisitic Macrocarrier holder  BIO-RAD 1652322
Bunsen burner VWR 89038-528
Calcium chloride Fisher Scientific C79-500
CSM -ADE Formedium DCS0049
CSM -ARG Formedium DCS0059
CSM -LEU Formedium DCS0099
CSM -URA Formedium DCS0169
Culture glass flask KIMAX KIMBLE 25615
Culture glass tube Pyrex 9820
Dextrose BD 215520
Ethanol JT Baker  9000
Forceps Millipore 620006
Glass beads Sigma Z265926
Glass handle Sigma S4647
Glycerol JT BAKER 2136-01
Helium tank grade 5 (99.99 %)
HSTaq  Kit PCR BIO
Microcentrifugue Eppendorf 022620100
NdeI New England BioLabs R0111L
Orbital shaker New Brunswick scientific NB-G25
PCR tubes Axygen PCR-02-C
PDS-1000/He TM Biolistic Particle Delivery System BIO-RAD 165-2257
Petri dishes (100X10) BD 252777
QIAprep Spin Miniprep Qiagen 27106
Raffinose Formedium RAF03
Replica plater Scienceware Z363391
Rupture discs 1350 Psi BIO-RAD 1652330
Sorbitol Sigma S7547
Spermidine Sigma S0266
T4 DNA Ligase Thermo Scientific EL0011
Tissue Culture Rotator Thermo Scientific 88882015
Tungsten microcarriers M10 BIO-RAD 1652266
Vaccum pump of 100L/min capacity
Velvet pads Bel-Art H37848-0002
Vortex  Scientifc Industries SI-0236
Wood aplicator stick PROMA 1820060
Yeast extract BD 212750
Yeast Nitrogen base without aminoacids BD 291920

References

  1. Bonnefoy, N., Fox, T. D. In vivo analysis of mutated initiation codons in the mitochondrial COX2 gene of Saccharomyces cerevisiae fused to the reporter gene ARG8m reveals lack of downstream reinitiation. Mol Gen Genet. 262 (6), 1036-1046 (2000).
  2. Franco, L. V. R., Su, C. H., McStay, G. P., Yu, G. J., Tzagoloff, A. Cox2p of yeast cytochrome oxidase assembles as a stand-alone subunit with the Cox1p and Cox3p modules. J Biol Chem. 293 (43), 16899-16911 (2018).
  3. Flores-Mireles, D., et al. The cytochrome b carboxyl terminal region is necessary for mitochondrial complex III assembly. Life Sci Alliance. 6 (7), (2023).
  4. Rubalcava-Gracia, D., Vázquez-Acevedo, M., Funes, S., Pérez-Martínez, X., González-Halphen, D. Mitochondrial versus nuclear gene expression and membrane protein assembly: the case of subunit 2 of yeast cytochrome. Mol Biol Cell. 29 (7), 820-833 (2018).
  5. García-Villegas, R., et al. The Cox1 C-terminal domain is a central regulator of cytochrome c oxidase biogenesis in yeast mitochondria. J Biol Chem. 292 (26), 10912-10925 (2017).
  6. Rak, M., et al. Yeast cells lacking the mitochondrial gene encoding the ATP synthase subunit 6 exhibit a selective loss of complex IV and unusual mitochondrial morphology. J Biol Chem. 282 (15), 10853-10864 (2007).
  7. Perez-Martinez, X., Broadley, S. A., Fox, T. D. Mss51p promotes mitochondrial Cox1p synthesis and interacts with newly synthesized Cox1p. EMBO J. 22 (21), 5951-5961 (2003).
  8. Sanchirico, M. E., Fox, T. D., Mason, T. L. Accumulation of mitochondrially synthesized Saccharomyces cerevisiae Cox2p and Cox3p depends on targeting information in untranslated portions of their mRNAs. EMBO J. 17 (19), 5796-5804 (1998).
  9. Saracco, S. A., Fox, T. D. Cox18p is required for export of the mitochondrially encoded Saccharomyces cerevisiae Cox2p C-tail and interacts with Pnt1p and Mss2p in the inner membrane. Mol Biol Cell. 13 (4), 1122-1131 (2002).
  10. McStay, G. P., Su, C. H., Thomas, S. M., Xu, J. T., Tzagoloff, A. Characterization of assembly intermediates containing subunit 1 of yeast cytochrome oxidase. J Biol Chem. 288 (37), 26546-26556 (2013).
  11. Golik, P., Bonnefoy, N., Szczepanek, T., Saint-Georges, Y., Lazowska, J. The Rieske FeS protein encoded and synthesized within mitochondria complements a deficiency in the nuclear gene. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (15), 8844-8849 (2003).
  12. Franco, L. V. R., et al. Allotopic expression of COX6 elucidates Atco-driven co-assembly of cytochrome oxidase and ATP synthase. Life Sci Alliance. 6 (11), e202301965 (2023).
  13. Mireau, H., Arnal, N., Fox, T. D. Expression of Barstar as a selectable marker in yeast mitochondria. Mol Genet Genomics. 270 (1), 1-8 (2003).
  14. Cohen, J. S., Fox, T. D. Expression of green fluorescent protein from a recoded gene inserted into Saccharomyces cerevisiae mitochondrial DNA. Mitochondrion. 1 (2), 181-189 (2001).
  15. Suhm, T., et al. A novel system to monitor mitochondrial translation in yeast. Microb Cell. 5 (3), 158-164 (2018).
  16. Rzepka, M., Suhm, T., Ott, M. Incorporation of reporter genes into mitochondrial DNA in budding yeast. STAR Protoc. 3 (2), 101359 (2022).
  17. Steele, D. F., Butler, C. A., Fox, T. D. Expression of a recoded nuclear gene inserted into yeast mitochondrial DNA is limited by mRNA-specific translational activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (11), 5253-5257 (1996).
  18. Flores-Mireles, D., Camacho-Villasana, Y., Pérez-Martínez, X. The ARG8m reporter for the study of yeast mitochondrial translation. Methods Mol Biol. 2661, 281-301 (2023).
  19. Perez-Martinez, X., Butler, C. A., Shingu-Vazquez, M., Fox, T. D. Dual functions of Mss51 couple synthesis of Cox1 to assembly of cytochrome c oxidase in Saccharomyces cerevisiae mitochondria. Mol Biol Cell. 20 (20), 4371-4380 (2009).
  20. Bonnefoy, N., Remacle, C., Fox, T. D. Genetic transformation of Saccharomyces cerevisiae and Chlamydomonas reinhardtii mitochondria. Methods Cell Biol. 80, 525-548 (2007).
  21. Veloso Ribeiro Franco, L., Barros, M. H. Biolistic transformation of the yeast Saccharomyces cerevisiae mitochondrial DNA. IUBMB Life. 75 (12), 972-982 (2023).
  22. Bonnefoy, N., Fox, T. D. Directed alteration of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial DNA by biolistic transformation and homologous recombination. Methods Mol Biol. 372, 153-166 (2007).
  23. Butow, R. A., Henke, R. M., Moran, J. V., Belcher, S. M., Perlman, P. S. Transformation of Saccharomyces cerevisiae mitochondria using the biolistic gun. Methods Enzymol. 264, 265-278 (1996).
  24. Bonnefoy, N., Fox, T. D. Genetic transformation of Saccharomyces cerevisiae mitochondria. Methods Cell Biol. 65, 381-396 (2001).
  25. Shingú-Vázquez, M., et al. The carboxyl-terminal end of Cox1 is required for feedback assembly regulation of Cox1 synthesis in Saccharomyces cerevisiae mitochondria. J Biol Chem. 285 (45), 34382-34389 (2010).
  26. Bonnefoy, N., Bsat, N., Fox, T. D. Mitochondrial translation of Saccharomyces cerevisiae COX2 mRNA is controlled by the nucleotide sequence specifying the pre-Cox2p leader peptide. Mol Cell Biol. 21 (7), 2359-2372 (2001).
  27. Meunier, B., Lemarre, P., Colson, A. M. Genetic screening in Saccharomyces cerevisiae for large numbers of mitochondrial point mutations which affect structure and function of catalytic subunits of cytochrome-c oxidase. Eur J Biochem. 213 (1), 129-135 (1993).
  28. Dorweiler, J. E., Manogaran, A. L. Cytoduction and plasmiduction in yeast. Bio Protoc. 11 (17), e4146 (2021).
  29. Zakharov, I. A., Yarovoy, B. P. Cytoduction as a new tool in studying the cytoplasmic heredity in yeast. Mol Cell Biochem. 14 (1-3), 15-18 (1977).
  30. Conde, J., Fink, G. R. A mutant of Saccharomyces cerevisiae defective for nuclear fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (10), 3651-3655 (1976).
  31. Burke, D., Dawson, D., Stearns, T. . Methods in yeast genetics : a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. , (2000).
  32. Dunham, M. J., Gartenberg, M. R., Brown, G. W. . Methods in yeast genetics and genomics : a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. , (2015).
  33. Ding, M. G., et al. Chapter 27 An improved method for introducing point mutations into the mitochondrial cytochrome B gene to facilitate studying the role of cytochrome B in the formation of reactive oxygen species. Methods Enzymol. 456, 491-506 (2009).
  34. Klein, C. J. L., Olsson, L., Nielsen, J. Glucose control in Saccharomyces cerevisiae: the role of Mig1 in metabolic functions. Microbiology (Reading). 144 (Pt 1), 13-24 (1998).
  35. Rolland, F., Winderickx, J., Thevelein, J. M. Glucose-sensing and -signalling mechanisms in yeast. FEMS Yeast Res. 2 (2), 183-201 (2002).
  36. Gruschke, S., et al. The Cbp3-Cbp6 complex coordinates cytochrome b synthesis with bc(1) complex assembly in yeast mitochondria. J Cell Biol. 199 (1), 137-150 (2012).
  37. Seshadri, S. R., Banarjee, C., Barros, M. H., Fontanesi, F. The translational activator Sov1 coordinates mitochondrial gene expression with mitoribosome biogenesis. Nucleic Acids Res. 48 (12), 6759-6774 (2020).
  38. Rak, M., Tzagoloff, A. F1-dependent translation of mitochondrially encoded Atp6p and Atp8p subunits of yeast ATP synthase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18509-18514 (2009).
  39. He, S., Fox, T. D. Mutations affecting a yeast mitochondrial inner membrane protein, pnt1p, block export of a mitochondrially synthesized fusion protein from the matrix. Mol Cell Biol. 19 (10), 6598-6607 (1999).
  40. Rak, M., et al. Regulation of mitochondrial translation of the ATP8/ATP6 mRNA by Smt1p. Mol Biol Cell. 27 (6), 919-929 (2016).
  41. Barrera-Paez, J. D., Moraes, C. T. Mitochondrial genome engineering coming-of-age. Trends Genet. 38 (8), 869-880 (2022).
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Citer Cet Article
Camacho-Villasana, Y., Pedroza-Dávila, U., Perez-Martinez, X. Mitochondrial Transformation in Baker's Yeast to Study Translation and Respiratory Complex Assembly. J. Vis. Exp. (208), e66856, doi:10.3791/66856 (2024).

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