Ici, nous décrivons un immunodosage fluorescent multiplex nouvellement développé qui utilise un système de cytométrie en flux à double rapporteur pour détecter simultanément deux épitopes uniques de protéine de pointe sur des particules virales intactes du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère sévère (SRAS-CoV-2) qui avaient été capturées par des microsphères magnétiques couplées à l’enzyme de conversion de l’angiotensine 2.
Les protéines membranaires des virus enveloppés jouent un rôle important dans de nombreuses fonctions biologiques impliquant l’attachement du virus aux récepteurs cellulaires cibles, la fusion de particules virales aux cellules hôtes, les interactions hôte-virus et la pathogenèse de la maladie. De plus, les protéines membranaires virales présentes sur les particules virales et présentées à la surface des cellules hôtes se sont avérées être d’excellentes cibles pour les antiviraux et les vaccins. Nous décrivons ici un protocole permettant d’étudier les protéines de surface sur des particules intactes du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) à l’aide du système de cytométrie en flux à double rapporteur. Le test exploite la technologie multiplex pour obtenir une triple détection des particules virales par trois réactions d’affinité indépendantes. Des billes magnétiques conjuguées à l’enzyme de conversion de l’angiotensine-2 humaine recombinante (ACE2) ont été utilisées pour capturer les particules virales du surnageant des cellules infectées par le SRAS-CoV-2. Ensuite, deux réactifs de détection marqués à la R-phycoérythrine (PE) ou au Brilliant Violet 421 (BV421) ont été appliqués simultanément. En tant que preuve de concept, des fragments d’anticorps ciblant différents épitopes de la protéine de surface Spike (S1) du SRAS-CoV-2 ont été utilisés. La détection de particules virales par trois réactions d’affinité indépendantes apporte une forte spécificité et confirme la capture de particules virales intactes. Des courbes dose-dépendance du surnageant cellulaire infecté par le SRAS-CoV-2 ont été générées avec des variances de coefficient de réplication (moyenne/ET) ˂14%. Les bonnes performances de dosage dans les deux canaux ont confirmé que deux épitopes protéiques cibles à la surface du virus sont détectables en parallèle. Le protocole décrit ici pourrait être appliqué pour (i) le profilage à haut multiplex et à haut débit des protéines de surface exprimées sur des virus enveloppés ; ii) détection de particules virales intactes actives ; et (iii) l’évaluation de la spécificité et de l’affinité des anticorps et des médicaments antiviraux pour les épitopes de surface des antigènes viraux. L’application peut être potentiellement étendue à tout type de vésicules extracellulaires et de bioparticules, exposant des antigènes de surface dans des fluides corporels ou d’autres matrices liquides.
Les virus pathogènes les plus courants, tels que la grippe, le VIH, le cytomégalovirus humain et les souches du SRAS-CoV, sont des virus enveloppés. L’infection cellulaire par des virus enveloppés nécessite la fusion des membranes virales et des cellules hôtes, ce qui entraîne la libération du génome viral dans le cytoplasme. L’ARN viral se répliquera ensuite avant d’être emballé dans une nouvelle particule virale 1,2. Au cours de ces processus, non seulement les protéines virales, mais aussi les protéines membranaires de l’hôte peuvent être incorporées dans l’enveloppe, devenant ainsi une partie intégrante de la nouvelle particule virale. Les protéines membranaires de la cellule hôte incorporées dans l’enveloppe du virus peuvent faciliter l’entrée du virus dans une nouvelle cellule hôte, en exploitant les mécanismes des interactions cellule-cellule, du guidage et de l’échappement du système immunitaire 3,4.
Malgré l’importance de l’étude des protéines associées aux virus, la plupart des techniques actuellement disponibles pour l’analyse des virus5 ne permettent pas une caractérisation à haut débit et à haut multiplex de l’antigène de surface du virus. Ils ne sont pas non plus capables de détecter des particules virales individuelles ou de faire la distinction entre les particules virales infectieuses intactes, l’ARN non infectieux, les protéines virales et les sous-populations virales exprimant des antigènes différents. Récemment, la cytométrie en flux a été modifiée et adaptée en une nouvelle méthode d’analyse des particules virales, à savoir la virométrie en flux. La virométrie en flux permet d’étudier des particules virales uniques et leurs antigènes de surface. Cependant, des limites telles qu’un faible débit, une faible capacité de multiplexage, une configuration expérimentale et une analyse de données compliquées et une détectabilité limitée des particules virales de petite taille demeurent 6,7.
La quantification multiplexée des protéines et des acides nucléiques basée sur les microsphères est une technologie bien établie avec de nombreuses applications allant de la quantification des protéines dans les fluides corporels, aux études d’interaction protéine-protéine et au diagnostic des infections virales 8,9,10,11,12,13 . Un instrument d’analyse de flux récemment introduit est doté d’un double canal rapporteur, permettant de mesurer deux molécules rapporteures fluorescentes dans le même puits de réaction. Cette nouvelle capacité s’est avérée particulièrement utile pour le profilage parallèle de différents isotypes14 de l’immunoglobuline. Ici, il est décrit comment le système à double rapporteur peut être utilisé pour détecter des particules virales intactes, en ciblant plusieurs antigènes de surface en parallèle.
En tant que preuve de concept, ce rapport détaille le développement d’un système de triple détection des particules du virus SARS-CoV-2. Le SRAS-CoV-2 se compose de quatre protéines principales, l’une est la protéine de pointe (S), qui se compose de deux sous-unités. La première sous-unité, S1, effectue la liaison primaire à l’ACE2 exprimé dans les membranes cellulaires humaines. La deuxième sous-unité, S2, facilite l’entrée dans la cellule cible par un peptide de fusion, créant un pore dans la membrane cellulaire cible dans lequel le virion peut pénétrer par15. Les trois éléments constitutifs restants du SRAS-CoV-2 sont la nucléocapside (N), la protéine membranaire (M) et la protéine d’enveloppe (E). La nucléocapside est responsable de l’emballage du génome viral en formant des structures ribonucléoprotéiques avec l’ARN, tandis que les protéines de membrane et d’enveloppe jouent un rôle central dans l’assemblage du virus.
Le test décrit ici cible trois épitopes indépendants de la sous-unité S1 exprimés à la surface de l’enveloppe du SARS-CoV-2. Des dilutions en série de surnageants cellulaires infectés et non infectés par le SRAS-CoV-2 sont utilisées. Les particules virales sont capturées via des microsphères conjuguées à l’ACE2 qui se lient à la sous-unité S1 du virus. La protéine S du virus de surface est ensuite détectée en parallèle avec un fragment variable à chaîne unique (scFv) d’immunoglobuline marqué dans le commerce et un anticorps monoclonal anti-S1 humain (Hu-anti-S1) ainsi qu’un scFv marqué FLAG développé en interne. Le Hu-anti-S1 est détecté par le premier canal (RP1) dans le système à double rapporteur avec l’anticorps secondaire IgG-Fc humain conjugué à la R-phycoérythrine (PE) orange, et le scFv est détecté par le deuxième canal (RP2) avec un anticorps secondaire anti-FLAG conjugué au bleu Brilliant Violet 421 (BV421). Le dosage des particules virales est représenté à la figure 1.
La technologie multiplex à base de billes s’est avérée être une plate-forme précieuse pour la détection d’agents pathogènes à haut débit dans un certain nombre d’applications cliniques. La grande flexibilité de la plateforme, basée sur les principes de la cytométrie en flux, permet de cibler les anticorps, les protéines et les acides nucléiques 18,19,20,21,22, en multiplexant des centaines d’analytes simultanément. Cependant, à notre connaissance, cette technologie n’a pas encore été appliquée pour détecter des particules virales intactes. Dans ce rapport, la technologie a été appliquée pour la détection de particules virales intactes en ciblant trois épitopes de surface indépendants du SRAS-CoV-2.
Les virus à ARN enveloppé présentent une grande similitude structurelle avec les vésicules extracellulaires (VE), de petites membranes phospholipidiques transportant l’ARN viral et les protéines ainsi que les protéines de l’hôte23. Des immunoessais sandwich ont déjà été appliqués à la détection des VE, en utilisant une paire d’anticorps ciblant deux protéines de surface distinctes24,25. La limitation des tests sandwich à ne détecter simultanément que deux protéines est éliminée par des approches multiplex qui permettent la détection simultanée de plus de deux protéines par réaction.
Le système de détection à trois lasers à double rapporteur décrit ici est l’instrument d’analyse d’écoulement à base de billes le plus avancé à ce jour. En ce qui concerne les systèmes de lecture à rapporteur unique, le double rapporteur (canaux RP1 et RP2) permet la détection de trois protéines/épitopes de surface en parallèle. Le ciblage de plusieurs protéines de surface et épitopes viraux fournit une représentation plus précise de la charge protéique virale, ce qui, au-delà de la confirmation que le virus est bien intact, ouvre également la possibilité d’étudier davantage les antigènes de surface viraux et les mécanismes des interactions entre les protéines virales et l’hôte.
Pendant la pandémie de COVID-19, il était important d’identifier rapidement les personnes porteuses de particules virales actives dans les efforts visant à contenir la propagation du virus. L’ARN génomique est détecté par RT-PCR quantitative quelle que soit son origine (particules virales intactes ou libres). Cependant, seule une enveloppe intacte avec la protéine S accessible peut servir de médiateur à l’entrée cellulaire et à la réplication ultérieure du virus. Des études antérieures avec des puces microfluidiques dans des échantillons de patients ont montré comment la détection de particules virales intactes combinée à des tests au point de service permettrait des tests fréquents et une surveillance accrue de la propagation de la maladie, y compris un choix plus éclairé des personnes à mettre en quarantaine26. L’application d’un test multiplexé basé sur des microsphères permettrait de concevoir des tests visant à cribler plusieurs virus et leurs variantes d’antigènes de surface, obtenant ainsi une image plus précise de la propagation du virus dans la population.
La virométrie en flux est un développement récent de la cytométrie en flux visant à l’analyse des particules virales. Bien qu’elle soit capable de détecter des particules virales discrètes, l’analyse de petits virus pose un problème actuel pour la virométrie en flux27,28. À l’instar de la méthode décrite ici, la virométrie en flux consiste à capturer des virions intacts par des nanoparticules d’or couplées à des anticorps. Les limites des deux méthodes comprennent (i) la dépendance à l’égard de réactifs de capture et de détection de haute affinité pour l’antigène exprimé en surface ciblé par les microsphères ou les nanoparticules, (ii) la capacité limitée de distinguer les particules virales des vésicules extracellulaires, et (iii) l’absence de normes pour une quantification appropriée des particules.
Les cellules sécrètent des VE dans leur environnement et, lorsqu’elles sont infectées par un virus, elles peuvent également sécréter des virions de taille similaire à celle des VE et peuvent éventuellement exprimer les mêmes antigènes29. Étant donné que les VE auront des compositions membranaires similaires à celles du virus, il pourrait être difficile de les distinguer les uns des autres en utilisant uniquement des méthodes basées sur l’affinité telles que l’approche à double laser à rapporteur unique. Cependant, les stratégies décrites ici présentent une capacité multiplex plus élevée, ce qui permet une étude plus large et plus approfondie de la composition protéique des particules. Les méthodes basées sur l’écoulement permettent de suivre des particules discrètes, offrant ainsi des possibilités de quantification numérique. Une stratégie pour résoudre le problème de la quantification dans notre méthode serait d’utiliser des vésicules synthétiques bien caractérisées exprimant des antigènes d’intérêt sous forme de particules pseudo-virales (VLP) pour préparer des courbes standard.
L’une des voies courantes d’entrée et de sortie du SRAS-CoV-2 à partir des cellules hôtes est l’interaction du virus et de la membrane de la cellule hôte 2,15. Dans ce processus, la probabilité que les protéines de la membrane de l’hôte soient incorporées à la surface du virus est élevée. En criblant les protéines de l’hôte incorporées, on peut suivre la voie de l’infection et potentiellement prédire l’évolution de la maladie pour différents patients à risque, ce qui permet de prendre des décisions de traitement plus précoces. Il permet également de caractériser les virus sur différents lots d’échantillons dans les laboratoires de recherche. Cela peut être exploré plus en profondeur en testant si différentes caractéristiques sont liées à différents niveaux d’infectiosité virale et pour le criblage d’anticorps et de molécules médicamenteuses qui ciblent les protéines de surface virales.
Un aspect important de la méthode décrite est qu’elle repose sur l’affinité des réactifs de capture et de détection contre leurs protéines cibles sur le virus. Le choix des réactifs d’affinité est donc un facteur déterminant dans la performance du dosage. Il est possible que plusieurs réactifs d’affinité doivent être examinés et testés pour la capture et la détection afin de sélectionner ceux qui ont la plus grande affinité. Ici, la performance de dix scFvs et de douze fragments de Fab a été évaluée de manière préliminaire à l’aide de RBD recombinante et sur des particules virales provenant du surnageant de cellules épithéliales pulmonaires Calu-3 infectées par le SRAS-Cov-2 (les cellules VeroE6 ont été utilisées pour cultiver/évaluer la cytotoxicité dans toutes les études ultérieures). L’anti-FLAG PE a été utilisé pour détecter les scFv marqués FLAG (tableau supplémentaire 1 et tableau supplémentaire 2). Les cinq scFv les plus performants ont ensuite été sélectionnés pour être appliqués dans le test à double rapporteur, en même temps que le Hu-anti-S1 commercial (tableau 1), sur des surnageants provenant de cellules épithéliales rénales de singe vert africain infectées par VeroE6.
Un autre facteur critique du succès du protocole est la procédure choisie pour le couplage des microsphères. La méthode de couplage doit être efficace et, en même temps, maintenir intacts et non modifiés les épitopes conformationnels ou les résidus d’acides aminés impliqués dans la liaison aux protéines. Ici, la réaction EDC-NHS a été appliquée pour coupler la neutravidine directement aux microsphères, en adaptant un protocole précédemment décrit30 et un système neutravidine + biotine pour lier l’ACE2 recombinant aux microsphères couplées. D’autres méthodes de couplage et leur efficacité peuvent être testées et comparées. Enfin, il a été observé que différents réactifs de détection marqués par fluorescence (p. ex., anti-FLAG PE (phycoérythrine) et anti-FLAG Brilliant Violet 421) peuvent entraîner des niveaux de MFI différents qui peuvent affecter la sensibilité du dosage.
En conclusion, la méthode décrite permet de détecter des particules virales intactes en solution, en appliquant une stratégie à double rapporteur. L’analyse de trois déterminants de surface en parallèle fournit un outil plus spécifique pour caractériser les particules virales et éventuellement les distinguer des autres VE (par exemple, ne contenant pas d’antigènes viraux). Cette stratégie est une alternative à la virométrie en flux. Bien que l’approche actuelle ne discrimine pas la taille des particules, les stratégies de billes magnétiques utilisant des microsphères codées par couleur offrent une capacité plus large de profilage d’antigènes de surface et de conception expérimentale par analyse à haut multiplex et à haut débit. Le test fait preuve d’une grande précision et d’une grande robustesse et peut être étendu à l’analyse de tout type de vésicule extracellulaire et de tout autre type de bioparticule exposant des antigènes de surface dans des fluides corporels ou d’autres matrices liquides. Il s’agissait d’une étude de preuve de concept qui a démontré l’utilité d’utiliser les scFvs comme réactif de détection dans une analyse multiplex de plusieurs épitopes protéiques sur des particules virales. Des études futures sont nécessaires pour déterminer les caractéristiques spécifiques des scFv (par exemple, les affinités de liaison, la réactivité croisée avec d’autres réactifs et cibles) s’ils doivent être utilisés à des fins quantitatives ou cliniques.
The authors have nothing to disclose.
Nous reconnaissons à SciLifeLab, en Suède, l’équipe de l’unité Scilifelab d’Affinity Proteomics-Stockholm pour le développement et l’application de la méthode décrite ici, l’unité Human Antibody Therapeutics pour la fourniture de réactifs scFvs et Fab, et Jonas Klingström pour les cellules VeroE6 infectées par des isolats de SARS-CoV-2 provenant d’échantillons cliniques. Les auteurs remercient Sherry Dunbar, PhD, MBA de Luminex Corporation (Austin, TX), pour son soutien à la recherche, et Matt Silverman MSci, PhD of Biomedical Publishing Solutions (Panama City, FL ; mattsilver@yahoo.com) pour son aide scientifique et rédactionnelle. Ce travail a été soutenu par des fonds de la Fondation Knut et Alice Wallenberg et du Laboratoire Science for Life (SciLifeLab) (VC2020-0015 à Claudia Fredolini et Francesca Chiodi et VC-2022-0028 à Claudia Fredolini).
ACE2-Biotin | Acro Biosystems (Newark, DE) | AC2-H82E6-25 ug | Conc: 340 µg/mL, LOT#BV35376-203HFI-2128 |
Anti-Goat IgG, PE-conjugated | Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA) | 705-116-147 | Host species: Donkey |
Anti-Human IgG R-PE | Life Technologies/Thermo Fisher (Waltham, MA) | H10104 | Conc: 0.15 mg/mL, LOT#2079224, Host species: Goat |
Anti-Mouse IgG, PE-conjugated | Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA) | 115-116-146 | Host species: Goat |
Anti-Rabbit IgG, PE-conjugated | Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA) | 111-116-144 | Host species: Goat |
Biotin | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA) | 20RUO | 100 mM, pH 10 Conc. 1 mg/mL |
Blocker Casein in PBS | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA) | 37528 | LOT#VD301372 |
Blocker reagent for ELISA (BRE) | Roche (Basel, Switzerland) | 11112589001 | |
Brilliant Violet 421 anti-DYKDDDDK Tag Antibody (Anti-FLAG) 0.2 mg/ml, rat IgG2a, λ | BioLegend (Amsterdam, The Netherlands) | 637321 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Saveen & Werner (Limhamn, Sweden) | B2000-500 | LOT#04D5865 |
EDC (1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride) | Proteochem (Hurricane, UT) | C1100-custom (65 mg) | LOT# MK3857 |
Fetal calf serum (FCS) | Gibco/Thermo Fisher (Waltham, MA) | 10270-106 | |
Goat anti-ACE2 polyclonal antibody | R&D Systems/Bio-Techne (Minneapolis, MN) | AF933 | Host species: Goat |
Goat IgG | Bethyl Labs (Montgomery, TX) | P50-200 | LOT#P50-200-6 |
L-glutamine | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA) | 25030024 | |
Low-bind 1.5 mL microfuge tubes | VWR (Radnor, PA) | 525-0133 | |
MagPlex-C Microspheres | Luminex Corporation (Austin, TX) | MC10XXX-01 | |
MEM tissue cuture media | Gibco/Thermo Fisher (Waltham, MA) | 21430-020 | |
Microplate, 96-Well, Polystyrene, Half-area, Clear | Greiner Bio-One (Kremsmünster, Austria) | 675101 | |
NaHCO3 | Gibco/Thermo Fisher (Waltham, MA) | 25080-060 | |
Neutravidin | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA) | 31000 | LOT#UK292857 |
PBS tablets | Medicago AB (Uppsala, Sweden) | 09-9400-100 | LOT#272320-01 |
Penicillin/Streptomycin | Gibco/Thermo Fisher (Waltham, MA) | 15140122 | |
Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 360627 | |
Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 437190 | |
ProClin 300 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 48915-U | |
Rabbit IgG | Bethyl Labs (Montgomery, TX) | P120-301 | LOT#12 |
scFv-FAb1 | In-house production | Human Antibody Therapeutics Unit, Scilifelab, Sweden. Monoclonal scFv. Conc: 0.12 mg/mL. | |
scFv-FAb2 | In-house production | Human Antibody Therapeutics Unit, Scilifelab, Sweden. Monoclonal scFv. Conc batch1: 0.38 mg/mL. Conc batch2: 0.45 mg/mL | |
scFv-FAb3 | In-house production | Human Antibody Therapeutics Unit, Scilifelab, Sweden. Monoclonal scFv. Conc: 0.34 mg/mL. | |
scFv-FAb4 | In-house production | Human Antibody Therapeutics Unit, Scilifelab, Sweden. Monoclonal scFv. Conc: 2.85 mg/mL. | |
scFv-FAb5 | In-house production | Human Antibody Therapeutics Unit, Scilifelab, Sweden. Monoclonal scFv. Conc:2.7mg/mL. | |
SARS-CoV-2 infectious particles, Swedish isolate | In-house production | The Public Health Agency of Sweden | |
SARS-CoV-2 Spike Antibody (Hu-anti-S1) | Novus Biologicals (Centennial, CO) | NBP2-90980 | Monoclonal antibody. Conc: 1 mg/mL. Host: Human. Clone: CR3022. Isotype: IgG1 Kappa. LOT#T201B06 |
Sodium phosphate monobasic, anhydrous | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | S3139 | |
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA) | 24510 | LOT# XH321563 |
Tween | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA) | BP337-50 | LOT#194435 |
Ultraviolet lamp | Vilber Lourmat GmbH (Eberhardzell, Germany) | VL-215.G | Wavelength = 254 nm; 2 × 15-watt bulbs |
Vero E6 cells | ATCC (Manassus, VA) | CRL-1586 | |
xMAP INTELLIFLEX DR-SE (dual-reporter flow instrument) | Luminex Corporation (Austin, TX) | INTELLIFLEX-DRSE-RUO |