Hier beschreiben wir einen neu entwickelten Multiplex-Fluoreszenz-Immunoassay, der ein durchflusszytometrisches System mit zwei Reportern verwendet, um gleichzeitig zwei einzigartige Spike-Protein-Epitope auf intakten Viruspartikeln des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) zu detektieren, die von Angiotensin-konvertierenden Enzym-2-gekoppelten magnetischen Mikrosphären eingefangen wurden.
Membranproteine auf behüllten Viren spielen eine wichtige Rolle bei vielen biologischen Funktionen, die die Anheftung von Viren an Zielzellrezeptoren, die Fusion von Viruspartikeln mit Wirtszellen, Wirt-Virus-Interaktionen und die Pathogenese von Krankheiten umfassen. Darüber hinaus haben sich virale Membranproteine auf Viruspartikeln und auf der Oberfläche von Wirtszellen als hervorragende Ziele für Virostatika und Impfstoffe erwiesen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Untersuchung von Oberflächenproteinen auf intakten Partikeln des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) mit Hilfe des Dual-Reporter-Durchflusszytometriesystems. Der Assay nutzt die Multiplex-Technologie, um einen dreifachen Nachweis von Viruspartikeln durch drei unabhängige Affinitätsreaktionen zu erzielen. Magnetische Kügelchen, die an rekombinantes humanes Angiotensin-konvertierendes Enzym-2 (ACE2) konjugiert waren, wurden verwendet, um Viruspartikel aus dem Überstand von Zellen einzufangen, die mit SARS-CoV-2 infiziert waren. Anschließend wurden zwei mit R-Phycoerythrin (PE) oder Brilliant Violet 421 (BV421) markierte Detektionsreagenzien gleichzeitig appliziert. Als Proof-of-Concept wurden Antikörperfragmente verwendet, die auf verschiedene Epitope des SARS-CoV-2-Oberflächenproteins Spike (S1) abzielen. Der Nachweis von Viruspartikeln durch drei unabhängige Affinitätsreaktionen sorgt für eine hohe Spezifität und bestätigt das Einfangen intakter Viruspartikel. Dosisabhängigkeitskurven von SARS-CoV-2-infizierten Zellüberständen wurden mit Replikatskoeffizienten-Varianzen (Mittelwert/SD) ˂14% erstellt. Die gute Assay-Leistung in beiden Kanälen bestätigte, dass zwei Zielprotein-Epitope auf der Virusoberfläche parallel nachweisbar sind. Das hier beschriebene Protokoll könnte angewendet werden für (i) High-Multiplex- und Hochdurchsatz-Profiling von Oberflächenproteinen, die auf behüllten Viren exprimiert werden; ii) Nachweis aktiver intakter Viruspartikel; und (iii) Bewertung der Spezifität und Affinität von Antikörpern und antiviralen Arzneimitteln für Oberflächenepitope viraler Antigene. Die Anwendung kann potenziell auf jede Art von extrazellulären Vesikeln und Biopartikeln ausgeweitet werden, wodurch Oberflächenantigene in Körperflüssigkeiten oder anderen flüssigen Matrizen freigelegt werden.
Die häufigsten pathogenen Viren wie Influenza, HIV, humane Cytomegalieviren und SARS-CoV-Stämme sind behüllte Viren. Eine Zellinfektion durch behüllte Viren erfordert die Fusion von Virus- und Wirtszellmembranen, was zur Freisetzung des viralen Genoms in das Zytoplasma führt. Die virale RNA repliziert sich dann, bevor sie in ein neues Viruspartikel gepackt wird 1,2. Während dieser Prozesse können nicht nur virale Proteine, sondern auch Proteine der Wirtsmembran in die Hülle eingebaut werden und so zu einem integralen Bestandteil des neuen Viruspartikels werden. In die Virushülle eingebaute Membranproteine der Wirtszelle können den Eintritt des Virus in eine neue Wirtszelle erleichtern und dabei die Mechanismen der Zell-Zell-Interaktionen, des Homing und der Flucht des Immunsystems ausnutzen 3,4.
Trotz der Bedeutung der Untersuchung virusassoziierter Proteine unterstützen die meisten der derzeit verfügbaren Techniken zur Virusanalyse5 keine Hochdurchsatz- und High-Multiplex-Charakterisierung des Virusoberflächenantigens. Sie sind auch nicht in der Lage, einzelne Viruspartikel nachzuweisen oder zwischen infektiösen intakten Viruspartikeln, nicht-infektiöser RNA, viralen Proteinen und Virussubpopulationen, die unterschiedliche Antigene exprimieren, zu unterscheiden. In jüngster Zeit wurde die Durchflusszytometrie modifiziert und zu einer neuartigen Methode zur Analyse von Viruspartikeln adaptiert, nämlich der Durchflussvirometrie. Die Flow-Virometrie ermöglicht die Untersuchung einzelner Viruspartikel und ihrer Oberflächenantigene. Einschränkungen wie geringer Durchsatz, geringe Multiplexfähigkeit, komplizierter Versuchsaufbau und Datenanalyse sowie eingeschränkte Nachweisbarkeit kleiner Viruspartikel bleiben jedoch bestehen 6,7.
Die mikrosphärenbasierte Multiplex-Quantifizierung von Proteinen und Nukleinsäuren ist eine etablierte Technologie mit zahlreichen Anwendungen, die von der Proteinquantifizierung in Körperflüssigkeiten über Protein-Protein-Interaktionsstudien bis hin zur Diagnose von Virusinfektionenreichen 8,9,10,11,12,13 . Ein kürzlich vorgestelltes Durchflussanalysegerät verfügt über einen Dual-Reporter-Kanal, der die Messung von zwei fluoreszierenden Reportermolekülen in derselben Reaktionsvertiefung ermöglicht. Diese neue Fähigkeit hat sich als besonders nützlich für die parallele Profilierung verschiedener Immunglobulin-Isotypenerwiesen 14. Hier wird beschrieben, wie das Dual-Reporter-System verwendet werden kann, um intakte Viruspartikel zu detektieren und dabei mehrere Oberflächenantigene parallel zu adressieren.
Als Proof of Concept beschreibt dieser Bericht die Entwicklung eines dreifachen Nachweissystems für SARS-CoV-2-Viruspartikel. SARS-CoV-2 besteht aus vier Hauptproteinen, eines davon ist das Spike-Protein (S), das aus zwei Untereinheiten besteht. Die erste Untereinheit, S1, bindet primär an das in menschlichen Zellmembranen exprimierte ACE2. Die zweite Untereinheit, S2, erleichtert den Eintritt in die Zielzelle durch ein Fusionspeptid, wodurch eine Pore in der Zielzellmembran entsteht, in die das Virion eindringen kann15. Die drei verbleibenden Bausteine von SARS-CoV-2 sind das Nukleokapsid (N), das Membranprotein (M) und das Hüllprotein (E). Das Nukleokapsid ist für die Verpackung des viralen Genoms verantwortlich, indem es mit RNA Ribonukleoproteinstrukturen bildet, während die Membran- und Hüllproteine eine zentrale Rolle bei der Virusassemblierung spielen.
Der hier beschriebene Assay zielt auf drei unabhängige Epitope der S1-Untereinheit ab, die auf der Hülloberfläche von SARS-CoV-2 exprimiert werden. Es werden serielle Verdünnungen sowohl von SARS-CoV-2-infizierten als auch von nicht infizierten Zellüberständen verwendet. Viruspartikel werden über ACE2-konjugierte Mikrosphären eingefangen, die die S1-Untereinheit an das Virus binden. Das S-Protein des Oberflächenvirus wird dann parallel zu einem kommerziell erhältlichen markierten Immunglobulin-Einzelketten-Variablen-Fragment (scFv) und einem humanen monoklonalen Anti-S1-Antikörper (Hu-anti-S1) zusammen mit einem eigens entwickelten FLAG-markierten scFv nachgewiesen. Das Hu-anti-S1 wird durch den ersten Kanal (RP1) im Dual-Reporter-System mit orangefarbenem R-Phycoerythrin (PE)-konjugiertem anti-humanem IgG-Fc-Sekundärantikörper detektiert, und das scFv wird durch den zweiten Kanal (RP2) mit einem blauen Brilliant Violet 421 (BV421)-konjugierten sekundären Anti-FLAG-Antikörper nachgewiesen. Der Viruspartikel-Assay ist in Abbildung 1 dargestellt.
Die Bead-basierte Multiplex-Technologie hat sich in einer Reihe von klinischen Anwendungen als wertvolle Plattform für den Nachweis von Krankheitserregern mit hohem Durchsatz erwiesen. Die hohe Flexibilität der Plattform, die auf den Prinzipien der Durchflusszytometrie basiert, ermöglicht das Targeting von Antikörpern, Proteinen und Nukleinsäuren 18,19,20,21,22 und das gleichzeitige Multiplexen von Hunderten von Analyten. Unseres Wissens nach wurde diese Technologie jedoch bisher nicht zum Nachweis intakter Viruspartikel eingesetzt. In diesem Bericht wurde die Technologie für den Nachweis intakter Viruspartikel eingesetzt, indem sie auf drei unabhängige Oberflächenepitope von SARS-CoV-2 abzielte.
Behüllte RNA-Viren zeigen eine hohe strukturelle Ähnlichkeit mit extrazellulären Vesikeln (EVs), kleinen Phospholipidmembranen, die virale RNA und Proteine zusammen mit Wirtsproteinen tragen23. Sandwich-Immunoassays wurden zuvor zum Nachweis von EVs eingesetzt, wobei ein Antikörperpaar verwendet wurde, das auf zwei unterschiedliche Oberflächenproteineabzielt 24,25. Die Einschränkung von Sandwich-Assays, nur zwei Proteine gleichzeitig zu detektieren, wird durch Multiplex-Ansätze aufgehoben, die den gleichzeitigen Nachweis von mehr als zwei Proteinen pro Reaktion ermöglichen.
Das hier beschriebene Drei-Laser-Dual-Reporter-Detektionssystem ist das bisher fortschrittlichste Instrument zur Strömungsanalyse auf Bead-Basis. In Bezug auf Single-Reporter-Auslesesysteme ermöglicht der Dual-Reporter (RP1- und RP2-Kanäle) die parallele Detektion von drei Oberflächenproteinen/Epitopen. Die Ausrichtung auf mehrere virale Oberflächenproteine und Epitope ermöglicht eine genauere Darstellung der viralen Proteinlast, die nicht nur bestätigt, dass das Virus tatsächlich intakt ist, sondern auch die Möglichkeit eröffnet, virale Oberflächenantigene und die Mechanismen der Wechselwirkungen zwischen dem Virus und dem Wirtsprotein weiter zu untersuchen.
Während der COVID-19-Pandemie war es wichtig, Personen mit aktiven Viruspartikeln rechtzeitig zu identifizieren, um die Ausbreitung des Virus einzudämmen. Genomische RNA wird unabhängig von ihrer Herkunft (intakte Viruspartikel oder frei) mittels quantitativer RT-PCR nachgewiesen. Allerdings kann nur eine intakte Hülle mit zugänglichem S-Protein den Zelleintritt und die anschließende Virusvermehrung vermitteln. Frühere Studien mit mikrofluidischen Chips in Patientenproben haben gezeigt, wie der Nachweis intakter Viruspartikel in Kombination mit Point-of-Care-Tests häufige Tests und eine verbesserte Überwachung der Krankheitsausbreitung ermöglichen würde, einschließlich einer fundierteren Entscheidung über Personen, die unter Quarantäne gestellt werden sollen26. Die Anwendung eines Multiplex-Mikrosphären-basierten Assays würde die Entwicklung von Assays ermöglichen, die auf das Screening mehrerer Viren und ihrer Oberflächenantigenvarianten abzielen und so ein genaueres Bild der Virusausbreitung in der Bevölkerung erhalten.
Die Durchflussvirometrie ist eine neue Entwicklung der Durchflusszytometrie, die auf die Analyse von Viruspartikeln abzielt. Trotz der Fähigkeit, diskrete Viruspartikel zu detektieren, stellt die Analyse kleiner Viren ein aktuelles Problem für die Flussvirometriedar 27,28. Ähnlich wie bei der hier beschriebenen Methode werden bei der Strömungsvirometrie intakte Virionen durch Goldnanopartikel eingefangen, die an Antikörper gekoppelt sind. Zu den Einschränkungen beider Methoden gehören (i) die Abhängigkeit von hochaffinen Erfassungs- und Detektionsreagenzien für oberflächenexprimiertes Antigen, auf das die Mikrosphären oder Nanopartikel abzielen, (ii) die eingeschränkte Fähigkeit, zwischen Viruspartikeln und extrazellulären Vesikeln zu unterscheiden, und (iii) das Fehlen von Standards für eine ordnungsgemäße Partikelquantifizierung.
Zellen sezernieren EVs in ihre Umgebung, und wenn sie mit einem Virus infiziert sind, können sie auch Virionen sezernieren, die ähnlich groß wie die EVs sind und schließlich die gleichen Antigene exprimieren können29. Da die EVs eine ähnliche Membranzusammensetzung wie das Virus haben, könnte es schwierig sein, sie nur mit affinitätsbasierten Methoden wie dem Dual-Laser-Single-Reporter-Ansatz voneinander zu unterscheiden. Die hier beschriebenen Strategien weisen jedoch eine höhere Multiplexkapazität auf, was eine breitere und tiefere Untersuchung der Proteinzusammensetzung der Partikel ermöglicht. Strömungsbasierte Methoden ermöglichen die Verfolgung diskreter Partikel und bieten so Möglichkeiten zur digitalen Quantifizierung. Eine Strategie, um das Quantifizierungsproblem in unserer Methode zu lösen, wäre die Verwendung gut charakterisierter synthetischer Vesikel, die Antigene von Interesse als virusähnliche Partikel (VLPs) exprimieren, für die Erstellung von Standardkurven.
Ein gemeinsamer Weg des Eintritts und Austritts von SARS-CoV-2 aus den Wirtszellen ist die Interaktion zwischen dem Virus und der Wirtszellmembran 2,15. Dabei ist die Wahrscheinlichkeit, dass Wirtsmembranproteine in die Virusoberfläche eingebaut werden, hoch. Durch das Screening von eingebauten Wirtsproteinen kann man den Weg der Infektion verfolgen und möglicherweise den Krankheitsverlauf für verschiedene Risikopatienten vorhersagen, was frühere Behandlungsentscheidungen ermöglicht. Es ermöglicht auch die Charakterisierung der Viren über verschiedene Probenchargen hinweg in Forschungslabors. Dies kann weiter erforscht werden, indem getestet wird, ob unterschiedliche Merkmale mit unterschiedlichen Niveaus der viralen Infektiosität zusammenhängen, und indem Antikörper und Wirkstoffmoleküle gescreent werden, die auf virale Oberflächenproteine abzielen.
Ein wichtiger Aspekt bei der beschriebenen Methode ist, dass sie auf der Affinität der Fang- und Nachweisreagenzien zu ihren Zielproteinen auf dem Virus beruht. Die Wahl der Affinitätsreagenzien ist daher ein entscheidender Faktor für die Assay-Leistung. Möglicherweise sollten mehrere Reagenzien mit hoher Affinität gescreent und auf ihre Erfassung und Detektion getestet werden, um diejenigen mit der höchsten Affinität auszuwählen. Hier wurde die Leistung von zehn scFvs und zwölf Fab-Fragmenten vorläufig mit rekombinanter RBD und an Viruspartikeln aus dem Überstand von SARS-Cov-2-infizierten Calu-3-Lungenepithelzellen bewertet (VeroE6-Zellen wurden in allen nachfolgenden Studien zur Kultivierung/Beurteilung der Zytotoxizität verwendet). Anti-FLAG PE wurde verwendet, um die mit FLAG markierten scFvs zu detektieren (Ergänzende Tabelle 1 und Ergänzende Tabelle 2). Die fünf leistungsstärksten scFvs wurden dann ausgewählt, um im Dual-Reporter-Assay zusammen mit kommerziellem Hu-anti-S1 (Tabelle 1) auf Überstände von infizierten VeroE6-Nierenepithelzellen des afrikanischen grünen Affen angewendet zu werden.
Ein weiterer kritischer Faktor für den Erfolg des Protokolls ist das gewählte Verfahren für die Mikrosphärenkopplung. Die Kopplungsmethode sollte effizient sein und gleichzeitig Konformationsepitope oder Aminosäurereste, die an der Proteinbindung beteiligt sind, intakt und unverändert halten. Hier wurde die EDC-NHS-Reaktion angewendet, um Neutravidin direkt an Mikrosphären zu koppeln, wobei ein zuvor beschriebenes Protokoll30 und ein Neutravidin + Biotin-System zur Bindung von rekombinantem ACE2 an die gekoppelten Mikrosphären angepasst wurden. Alternative Kopplungsverfahren und deren Wirkungsgrad können getestet und verglichen werden. Schließlich wurde beobachtet, dass verschiedene fluoreszenzmarkierte Detektionsreagenzien (z. B. anti-FLAG PE (Phycoerythrin) und anti-FLAG Brilliant Violet 421) zu unterschiedlichen MFI-Werten führen können, die die Sensitivität des Assays beeinflussen können.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das beschriebene Verfahren den Nachweis von intakten Viruspartikeln in Lösung unter Anwendung einer Dual-Reporter-Strategie ermöglicht. Die parallele Analyse von drei Oberflächendeterminanten bietet ein spezifischeres Werkzeug, um virale Partikel zu charakterisieren und sie schließlich von anderen EVs (z. B. die keine viralen Antigene enthalten) zu unterscheiden. Diese Strategie ist eine Alternative zur Flow-Virometrie. Obwohl der derzeitige Ansatz keine Partikelgrößen unterscheidet, bieten magnetische Bead-Strategien mit farbcodierten Mikrosphären eine breitere Möglichkeit bei der Erstellung von Oberflächenantigen-Profilen und der Versuchsplanung durch Hochmultiplex- und Hochdurchsatzanalyse. Der Assay zeigt eine hohe Präzision und Robustheit und kann auf die Analyse jeder Art von extrazellulärem Vesikel und jeder anderen Art von Biopartikeln erweitert werden, die Oberflächenantigene in Körperflüssigkeiten oder anderen flüssigen Matrices freilegen. Dabei handelte es sich um eine Proof-of-Concept-Studie, die den Nutzen der Verwendung von scFvs als ein Nachweisreagenz in einer Multiplex-Analyse mehrerer Proteinepitope auf Viruspartikeln demonstrierte. Zukünftige Studien sind notwendig, um die spezifischen Eigenschaften von scFvs (z. B. Bindungsaffinitäten, Kreuzreaktivität mit anderen Reagenzien und Zielmolekülen) zu bestimmen, wenn sie für quantitative oder klinische Zwecke verwendet werden sollen.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken im SciLifeLab, Schweden, dem Team der Affinity Proteomics-Stockholm Scilifelab Unit für die Entwicklung und Anwendung der hier beschriebenen Methode, der Human Antibody Therapeutics Unit für die Bereitstellung von scFvs und Fab-Reagenzien und Jonas Klingström für die VeroE6-Zellen, die mit SARS-CoV-2-Isolaten aus klinischen Proben infiziert wurden. Die Autoren danken Sherry Dunbar, PhD, MBA der Luminex Corporation (Austin, TX), für die Unterstützung der Forschung und Matt Silverman MSci, PhD of Biomedical Publishing Solutions (Panama City, FL; mattsilver@yahoo.com) für die wissenschaftliche und redaktionelle Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch Mittel der Knut and Alice Wallenberg Foundation und des Science for Life Laboratory (SciLifeLab) unterstützt (VC2020-0015 an Claudia Fredolini und Francesca Chiodi und VC-2022-0028 an Claudia Fredolini).
ACE2-Biotin | Acro Biosystems (Newark, DE) | AC2-H82E6-25 ug | Conc: 340 µg/mL, LOT#BV35376-203HFI-2128 |
Anti-Goat IgG, PE-conjugated | Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA) | 705-116-147 | Host species: Donkey |
Anti-Human IgG R-PE | Life Technologies/Thermo Fisher (Waltham, MA) | H10104 | Conc: 0.15 mg/mL, LOT#2079224, Host species: Goat |
Anti-Mouse IgG, PE-conjugated | Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA) | 115-116-146 | Host species: Goat |
Anti-Rabbit IgG, PE-conjugated | Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA) | 111-116-144 | Host species: Goat |
Biotin | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA) | 20RUO | 100 mM, pH 10 Conc. 1 mg/mL |
Blocker Casein in PBS | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA) | 37528 | LOT#VD301372 |
Blocker reagent for ELISA (BRE) | Roche (Basel, Switzerland) | 11112589001 | |
Brilliant Violet 421 anti-DYKDDDDK Tag Antibody (Anti-FLAG) 0.2 mg/ml, rat IgG2a, λ | BioLegend (Amsterdam, The Netherlands) | 637321 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Saveen & Werner (Limhamn, Sweden) | B2000-500 | LOT#04D5865 |
EDC (1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride) | Proteochem (Hurricane, UT) | C1100-custom (65 mg) | LOT# MK3857 |
Fetal calf serum (FCS) | Gibco/Thermo Fisher (Waltham, MA) | 10270-106 | |
Goat anti-ACE2 polyclonal antibody | R&D Systems/Bio-Techne (Minneapolis, MN) | AF933 | Host species: Goat |
Goat IgG | Bethyl Labs (Montgomery, TX) | P50-200 | LOT#P50-200-6 |
L-glutamine | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA) | 25030024 | |
Low-bind 1.5 mL microfuge tubes | VWR (Radnor, PA) | 525-0133 | |
MagPlex-C Microspheres | Luminex Corporation (Austin, TX) | MC10XXX-01 | |
MEM tissue cuture media | Gibco/Thermo Fisher (Waltham, MA) | 21430-020 | |
Microplate, 96-Well, Polystyrene, Half-area, Clear | Greiner Bio-One (Kremsmünster, Austria) | 675101 | |
NaHCO3 | Gibco/Thermo Fisher (Waltham, MA) | 25080-060 | |
Neutravidin | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA) | 31000 | LOT#UK292857 |
PBS tablets | Medicago AB (Uppsala, Sweden) | 09-9400-100 | LOT#272320-01 |
Penicillin/Streptomycin | Gibco/Thermo Fisher (Waltham, MA) | 15140122 | |
Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 360627 | |
Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 437190 | |
ProClin 300 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 48915-U | |
Rabbit IgG | Bethyl Labs (Montgomery, TX) | P120-301 | LOT#12 |
scFv-FAb1 | In-house production | Human Antibody Therapeutics Unit, Scilifelab, Sweden. Monoclonal scFv. Conc: 0.12 mg/mL. | |
scFv-FAb2 | In-house production | Human Antibody Therapeutics Unit, Scilifelab, Sweden. Monoclonal scFv. Conc batch1: 0.38 mg/mL. Conc batch2: 0.45 mg/mL | |
scFv-FAb3 | In-house production | Human Antibody Therapeutics Unit, Scilifelab, Sweden. Monoclonal scFv. Conc: 0.34 mg/mL. | |
scFv-FAb4 | In-house production | Human Antibody Therapeutics Unit, Scilifelab, Sweden. Monoclonal scFv. Conc: 2.85 mg/mL. | |
scFv-FAb5 | In-house production | Human Antibody Therapeutics Unit, Scilifelab, Sweden. Monoclonal scFv. Conc:2.7mg/mL. | |
SARS-CoV-2 infectious particles, Swedish isolate | In-house production | The Public Health Agency of Sweden | |
SARS-CoV-2 Spike Antibody (Hu-anti-S1) | Novus Biologicals (Centennial, CO) | NBP2-90980 | Monoclonal antibody. Conc: 1 mg/mL. Host: Human. Clone: CR3022. Isotype: IgG1 Kappa. LOT#T201B06 |
Sodium phosphate monobasic, anhydrous | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | S3139 | |
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA) | 24510 | LOT# XH321563 |
Tween | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA) | BP337-50 | LOT#194435 |
Ultraviolet lamp | Vilber Lourmat GmbH (Eberhardzell, Germany) | VL-215.G | Wavelength = 254 nm; 2 × 15-watt bulbs |
Vero E6 cells | ATCC (Manassus, VA) | CRL-1586 | |
xMAP INTELLIFLEX DR-SE (dual-reporter flow instrument) | Luminex Corporation (Austin, TX) | INTELLIFLEX-DRSE-RUO |